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    6羥基多巴誘導(dǎo)的帕金森細(xì)胞模型中Hsp60的定位表達(dá)研究

    2012-02-08 06:21:52張靈馮美江
    實用老年醫(yī)學(xué) 2012年3期
    關(guān)鍵詞:膠質(zhì)帕金森病孵育

    張靈 馮美江

    帕金森病(PD)是老年人最常見的疾病之一。PD是一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,以黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元減少為其主要病理特征。隨著對PD發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入,人們越來越認(rèn)識到以小膠質(zhì)細(xì)胞活化為主的免疫炎癥在PD發(fā)生及發(fā)展中的重要作用[1]。此外,近年來的研究表明,心肌梗死和神經(jīng)系統(tǒng)損傷后熱休克蛋白60(Hsp60)可從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外,通過免疫炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重神經(jīng)損傷[2]。本研究將初步探討Hsp60在6羥基多巴(6-OHDA)誘導(dǎo)的帕金森細(xì)胞模型中的定位表達(dá)變化及其可能意義。

    1 材料和方法

    1.1 細(xì)胞、試劑和儀器PC12(腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系)細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。6-OHDA、維生素C(VitC)、二甲基亞砜(DMSO)、DMEM高糖培養(yǎng)基(達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基)、胰蛋白酶購自Sigma公司。胎牛血清購自Gibco公司,抗-Hsp60抗體購自Santa Cruz公司。熒光二抗、煙酸己可堿(Hoechst,用以染核)、Bio二抗購自Jackson公司。熒光倒置顯微鏡為Leica公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):用含10%的胎牛血清、100 μg/ml青霉素/鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,隔天換液。待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后,用0.25%的胰蛋白酶消化后,以2×105/ml密度接種于底面積25 cm2的培養(yǎng)瓶(15 ml/瓶)。

    1.2.2 免疫印記(Western Blot)檢測:孵育24 h后,實驗組和對照組分別加入含0.2%VitC的6-OHDA溶液(終濃度為100 μmol/L)和0.2%VitC溶液(終濃度為0.002%),分別繼續(xù)孵育3 h、6 h、12 h、24 h、48 h后吸去培養(yǎng)液,加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,經(jīng)與抗-Hsp60抗體(稀釋濃度為1∶500)和相應(yīng)的二抗(稀釋濃度為1∶1000)孵育,再用ECL試劑盒顯示蛋白。各時間點(diǎn)收取的培養(yǎng)液上清離心后同上步驟孵育完一抗,后加生物素二抗放大,用ECL試劑盒顯示蛋白。

    1.2.3 細(xì)胞免疫熒光:將PC12細(xì)胞接種到放有小圓片的24孔板,孵育24 h后,實驗組和正常對照組分別加入含0.2%VitC的6-OHDA溶液(終濃度為100 μmol/L)和0.2%VitC溶液(終濃度為0.002%),分別繼續(xù)孵育3 h、6 h、12 h、24 h、48 h后吸去培養(yǎng)液,細(xì)胞多聚甲醛固定,10%驢血清封閉后與抗-Hsp60抗體(稀釋濃度為1∶100)和相應(yīng)的二抗(稀釋濃度為1∶1000)及Hoechst(稀釋濃度為1∶800)孵育,用熒光倒置顯微鏡觀察。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,各實驗組間比較用單因素方差分析(one way ANOVA),每組數(shù)據(jù)來自至少3次重復(fù)實驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 PC12細(xì)胞蛋白表達(dá)變化隨著6-OHDA作用時間延長,Hsp60在PC12細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)降低的趨勢,24 h和48 h時間點(diǎn)的蛋白表達(dá)與正常對照組相比明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

    圖1 Hsp60在PC12細(xì)胞中的表達(dá)水平

    2.2 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果細(xì)胞免疫熒光顯示,Hsp60在正常PC12細(xì)胞的胞漿中表達(dá),模型組的PC12在6-OHDA作用下胞體逐漸變小、皺縮,胞核不均勻高亮染色。Hsp60表達(dá)信號成環(huán)形并且相對于正常對照組有明顯減少趨勢,這與細(xì)胞蛋白的表達(dá)結(jié)果一致,見圖2。

    圖2 細(xì)胞免疫熒光檢測Hsp60在PC12細(xì)胞胞漿中表達(dá)水平

    2.3 培養(yǎng)上清液中Hsp60表達(dá)變化Hsp60在正常對照組的培養(yǎng)上清液中檢測不到表達(dá)信號,而在模型組則可明確檢測到表達(dá)信號,并且隨著時間延長呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢,24 h和48 h時間點(diǎn)的Hsp60表達(dá)與3 h時間點(diǎn)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

    圖3 培養(yǎng)上清液中Hsp60蛋白表達(dá)水平

    3 討論

    PD是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病,在≥65歲的人群中發(fā)病率約為1.7%。PD主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動遲緩、姿勢步態(tài)異常等,嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量。但因PD發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前臨床上針對該病主要是對癥治療[3-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn),PD黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的減少往往伴隨著小膠質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)活化[5]。多巴胺能神經(jīng)元損傷可釋放損傷因子,某些損傷因子在胞外可以與小膠質(zhì)細(xì)胞表面受體結(jié)合從而活化小膠質(zhì)細(xì)胞。目前認(rèn)為,以小膠質(zhì)細(xì)胞活化為主要特征的免疫炎癥反應(yīng)在PD的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮至關(guān)重要的作用[6-7]。

    熱休克蛋白(Hsps)是一種應(yīng)激蛋白,Hsp60是Hsps家族中的重要一員。最初研究認(rèn)為,Hsp60作為線粒體蛋白主要表達(dá)在胞漿[8]。近年來,Hsp60的細(xì)胞外作用已引起高度重視并成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),心衰時Hsp60可轉(zhuǎn)位到胞膜[9],細(xì)胞外的Hsp60可通過活化Toll樣受體4(TLR-4)介導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡[10]。Hsp60還可被瀕死細(xì)胞和壞死細(xì)胞釋放到胞外,作為損傷信號發(fā)揮胞外作用[11]。腫瘤細(xì)胞也可分泌Hsp60從而發(fā)揮胞外作用[12]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),損傷的神經(jīng)元可釋放Hsp60到胞外,細(xì)胞外的Hsp60可通過TLR-4-Myd88信號通路活化小膠質(zhì)細(xì)胞[2],從而引發(fā)免疫炎癥反應(yīng)。在PD,小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)過度活化可產(chǎn)生大量炎癥因子,如TNF-α、IL-1、IL-6和iNOS[13-15]。這些炎癥因子可能通過氧化應(yīng)激和引發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步加重神經(jīng)元的損害[16]。

    本研究表明,6-OHDA作用24 h和48 h后,PC12細(xì)胞內(nèi)Hsp60的表達(dá)與正常對照組相比明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而培養(yǎng)上清液中可明確檢測到Hsp60表達(dá),且隨時間延長而表達(dá)逐漸增多。我們的研究結(jié)果有力地證實了Hsp60在PD細(xì)胞模型中可被釋放到胞外。我們推測,釋放到細(xì)胞外的Hsp60可能通過某種機(jī)制參與活化小膠質(zhì)細(xì)胞并導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)一步損傷,從而參與PD的發(fā)生與發(fā)展。

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