Exonuclease-1缺失延緩端粒酶缺失小鼠造血微環(huán)境的衰老

石桂英，林培容，白 琳，鞠振宇

（1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021；2北京華信醫(yī)院，北京 100016）

人類衰老過程中的一個重要表現(xiàn)是各器官再生能力及穩(wěn)態(tài)維持能力的降低，這與衰老過程中成體干細(xì)胞功能下降有關(guān)［1-3］。細(xì)胞微環(huán)境的變化可以影響成體干細(xì)胞功能［4］，而環(huán)境變化會影響再生醫(yī)學(xué)中干細(xì)胞移植的應(yīng)用。目前，衰老過程中干細(xì)胞微環(huán)境變化的分子機制尚不明確。研究表明，端粒酶基因突變和端?？s短是人類衰老和骨髓衰竭性疾病發(fā)生的重要原因之一［5，6］。端粒酶缺陷小鼠的建立為研究端粒與人類衰老的機制提供了重要的模型動物。Exonuclease-1（Exo-1）是一種核酸外切酶，是DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵點基因［7］。前期研究發(fā)現(xiàn)Exo-1缺失延長了端粒酶基因缺陷小鼠的壽命［8］。然而，在第三代Terc和Exo-1雙基因敲除小鼠（G3 Terc-/-Exo-1-/-）小鼠中，不但小鼠的整體環(huán)境是雙基因敲除，而且造血干細(xì)胞也是雙基因敲除。為進(jìn)一步明確，Exo-1基因敲除對端粒酶缺陷小鼠骨髓造血系統(tǒng)的影響是通過改善造血干細(xì)胞微環(huán)境來起作用的，我們通過骨髓移植實驗，然后分析野生型供體造血干細(xì)胞在不同受體微環(huán)境中的功能，來研究Exo-1對端粒酶缺失小鼠造血微環(huán)境衰老的影響。

1 材料和方法

1.1 Exo-1、Terc雙基因敲除小鼠

Exo-1基因敲除小鼠由德國引進(jìn)，Terc基因敲除小鼠及CD45.1小鼠由美國Jackson Laboratory引進(jìn)。Exo-1、Terc雙基因敲除小鼠本實驗室繁育。動物許可證號SCXK（京）2009-0007。

G3 Terc-/-及G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠在3～4月齡時，接受4.5Gy放射線照射，4 h內(nèi)眼后注射野生型CD45.1小鼠全骨髓細(xì)胞，約250μL，含1×107細(xì)胞，移植后一周給予抗生素預(yù)防感染。

1.2 基因敲除小鼠的基因型鑒定

用2周齡小鼠尾尖堿裂解法提取基因組DNA，PCR鑒定基因型。TERC敲除小鼠鑒定引物為：mTRR：5＇-TTCTGACCACCACCAACTTCAAT-3＇，5PPgK：5＇-G GGGCTGCTAAAGCGCAT-3＇，mTRW tF：5＇-CTAAG CCGGCACTCCTTACAAG-3＇。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 m in；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 m in。野生型片段為250bp，TERC敲除片段為180 bp。Exo-1敲除小鼠鑒定引物為：Primer A：5＇-CTTCGCTTTATGAAGC AGCC-3＇，Primer B：5＇-AGGAGTAGAAGTGGCGCG AAGG-3＇，Primer C：5＇-AGGAAAGAGTCAGAGTGC TGGC-3＇。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 m in。野生型片段為318 bp，Exo-1敲除片段為349 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20μL（試劑購自寶生物工程有限公司）。

1.3 制備單細(xì)胞懸液

移植用骨髓細(xì)胞取自2～3月齡CD45.1小鼠。小鼠脫頸椎處死后，無菌條件下，剝離后腿骨肌肉，用冰上預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗骨髓腔，獲得全骨髓細(xì)胞，定容至10 m L，50μm濾膜過濾，混勻后，取10 μL細(xì)胞，稀釋10倍，計數(shù)。水平轉(zhuǎn)子離心，1000 rpm，10 m in，棄上清，加適量染色緩沖液，調(diào)整至需要濃度。

移植后的受體小鼠在9月齡時安樂死后，剝離后腿骨肌肉，用冰上預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗骨髓腔，獲得全骨髓細(xì)胞；胸腺研磨成細(xì)胞懸液；脾臟縱切成兩半后，一半研磨成細(xì)胞懸液，一半用10％福爾馬林固定，進(jìn)行HE染色。上述細(xì)胞懸液，50μm濾膜過濾，混勻后，取10μL細(xì)胞，稀釋10倍，計數(shù)。水平轉(zhuǎn)子離心，1000 rpm，10 m in，棄上清，加適量染色緩沖液，調(diào)整至108細(xì)胞/m L。

1.4 標(biāo)記抗體

外周血細(xì)胞30μL，加入CD4-FITC、CD45.1-PE、CD45.2-PerCP-Cy5.5、B220-PE-Cy7、CD11b-APC、CD8-APC-Cy7混合液，冰上靜置30 m in，加1 m L PBS，離心，2600 rpm，5 m in，棄上清，加200μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，50μm濾膜過濾，備流式分析。

骨髓細(xì)胞中髓系染色抗體為B220-FITC、CD45.1-PE、CD45.2-PerCP-Cy5.5、Gr1-PE-Cy7、CD11c-APC、CD11b-APC-Cy7；B系淋巴細(xì)胞染色抗體為IgD-FITC、CD45.1-PE、CD45.2-PerCP-Cy5.5、B220-PE-Cy7、IgM-APC、CD43-Biotin、SA-APC-Cy7。染色時先加入CD43-Biotin，冰上靜置30 m in，加1 m L PBS，離心，2600 rpm，5 min，棄上清，再加入其它抗體混合物，冰上靜置30 min，加1 m L PBS，離心，2600 rpm，5 min，棄上清，加200μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，50μm濾膜過濾，備流式分析。

2 結(jié)果

2.1 Exo-1缺失改善骨髓造血干細(xì)胞的微環(huán)境

為研究Exo-1對骨髓微環(huán)境的影響，我們分析了骨髓中供體來源的B淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞，以及B淋巴細(xì)胞的發(fā)育情況。流式分析結(jié)果顯示，G3Terc-/-Exo-1-/-小鼠骨髓中供體來源的B220+細(xì)胞的比例高于G3 Terc-/-小鼠（P=0.04），而CD11b+Gr1+的髓系細(xì)胞比例低于G3 Terc-/-小鼠，但差別無顯著性（P=0.1216）；對不同發(fā)育階段的B淋巴細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠骨髓中供體來源的Pre B細(xì)胞的比例明顯高于G3 Terc-/-小鼠（P=0.01274），而成熟B細(xì)胞的比例明顯低于G3 Terc-/-小鼠（P=0.0004）（見圖1）。這說明Exo-1缺失改善了骨髓造血干細(xì)胞的微環(huán)境，從而使供體來源的野生型小鼠骨髓造血干細(xì)胞正常分化。

2.2 Exo-1缺失改善脾臟B細(xì)胞發(fā)育成熟的微環(huán)境

為研究Exo-1對脾臟微環(huán)境的影響，我們對受體小鼠中供體來源的脾臟細(xì)胞進(jìn)行分析。流式分析結(jié)果顯示，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠脾臟中B220+細(xì)胞的比例高于G3 Terc-/-小鼠（P= 0.001），而CD11b+Gr1+細(xì)胞的比例下降，但差異無顯著性（P=0.1268）（見圖2）。這說明Exo-1缺失改善了脾臟細(xì)胞的微環(huán)境，從而使野生型小鼠脾臟細(xì)胞正常發(fā)育成熟。

2.3 Exo-1缺失改善胸腺T細(xì)胞生長發(fā)育環(huán)境

為研究Exo-1對胸腺微環(huán)境的影響，我們對受體小鼠中供體來源的胸腺細(xì)胞進(jìn)行了分析。對胸腺細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠胸腺細(xì)胞總數(shù)明顯高于G3 Terc-/-小鼠（P=0.0024）。對胸腺細(xì)胞的流式分析結(jié)果顯示，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠胸腺中CD4、CD8雙陽性細(xì)胞的比例高于G3 Terc-/-小鼠（P=0.0428），見圖3。這說明Exo-1缺失改善了胸腺細(xì)胞的微環(huán)境，從而使T淋巴細(xì)胞在胸腺中正常發(fā)育分化。

2.4 外周血細(xì)胞分析

圖2 供體來源的脾臟細(xì)胞分析圖Fig.2 Analysis of donor derived spleen cells注：A：脾臟中供體來源的B220+細(xì)胞及CD11b+細(xì)胞流式分析圖；B：脾臟中供體來源的CD11b+Gr1+細(xì)胞流式分析圖；C：脾臟中供體來源的B220+細(xì)胞和CD11b+ Gr1+細(xì)胞所占比例Note：A：representative FACS plot of B220+cells and CD11b+cells in donor derived splenocyte；B：representative FACS plot of Gr1+cells and CD11b+cells in donor derived splenocyte；C：percentage of donor derived B220+cells and CD11b+Gr1+cells in spleen

外周血中各種細(xì)胞的比例反應(yīng)了骨髓和脾臟的造血能力，以及骨髓造血干細(xì)胞的多系分化能力。本研究對小鼠外周血流式分析結(jié)果顯示，G3 Terc-/-Exo-1-/-受體小鼠外周血中供體來源的B淋巴細(xì)胞的比例高于G3 Terc-/-受體小鼠（P= 0.04，見圖4）。這說明Exo-1缺失改善造血干細(xì)胞的微環(huán)境，從而使供體來源野生型小鼠骨髓造血干細(xì)胞正常發(fā)育分化，維持外周血中各種血細(xì)胞比例的穩(wěn)定。

圖3 供體來源的胸腺細(xì)胞流式分析圖Fig.3 Analysis of donor derived thymus cells注：A：胸腺中供體來源的T淋巴細(xì)胞流式分析圖；B：胸腺細(xì)胞總數(shù)；C：胸腺中供體來源的CD4、CD8雙陽性細(xì)胞所占比例Note：A：representative FACS p lot of CD4+and CD8+T lymphocyte cells in the thymus； B：number of total thymus cells；C：percentage of donor derived CD4，CD8 double positive cells in the thymus

3 討論

本研究中應(yīng)用端粒功能障礙引起的衰老小鼠G3 Terc-/-小鼠和G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠為受體，CD45.1小鼠為供體，分離骨髓細(xì)胞后，進(jìn)行骨髓移植。在受體小鼠9月齡時取小鼠骨髓、脾臟、胸腺等組織器官進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G3 Terc-/-Exo-14/-小鼠骨髓細(xì)胞中供體來源的B220+細(xì)胞的發(fā)育得到改善，在骨髓細(xì)胞中所占比例高于G3 Terc-/-小鼠，而且PreB細(xì)胞在B220+細(xì)胞中的比例明顯升高，可見Exo-1缺失改善了骨髓細(xì)胞的環(huán)境，延緩了骨髓微環(huán)境的衰老，從而使供體來源的骨髓造血干細(xì)胞能夠正常發(fā)育分化（見圖1）。對脾臟的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠脾臟供體來源的B220+細(xì)胞的比例顯著高于G3 Terc-/-小鼠（P= 0.001），可見Exo-1缺失改善了脾臟細(xì)胞環(huán)境（見圖2）。Exo-1缺失改善環(huán)境的作用在胸腺發(fā)育中更為明顯，G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠的胸腺細(xì)胞總數(shù)明顯多于G3 Terc-/-小鼠（P=0.0024）；從細(xì)胞發(fā)育來看，G3 Terc-/-小鼠供體來源的CD4、CD8雙陽性細(xì)胞的比例明顯降低，Exo-1缺失改善了這種狀況，在G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠中供體來源的雙陽性細(xì)胞的比例明顯升高（見圖3）。對外周血的分析也得出同樣結(jié)果，即G3 Terc-/-Exo-1-/-小鼠外周血中供體來源的B220+細(xì)胞明顯高于G3 Terc-/-小鼠小鼠（見圖4）。綜上可見，Exo-1缺失改善了端粒酶缺失小鼠的細(xì)胞微環(huán)境，延緩了造血系統(tǒng)微環(huán)境的衰老，從而使植入的野生型骨髓造血干細(xì)胞正常發(fā)育分化。

圖4 供體來源的外周血細(xì)胞分析圖Fig.4 Analysis of donor derived peripheral blood cells注：A：外周血中供體來源的B220+細(xì)胞及CD11b+細(xì)胞流式分析圖；B：外周血中供體來源的B220+細(xì)胞和CD11b+細(xì)胞所占比例Note：A：representative FACS p lot of B220+cells and CD11b+cells in the donor derived peripheral blood；B：percentage of donor derived B220+cells and CD11b+cells in the peripheral blood

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