• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小鼠抗食蟹猴IgG單克隆抗體的制備

    2012-12-01 00:56:02張段玲張彥龍白素英
    關(guān)鍵詞:食蟹雜交瘤恒河

    張段玲,張彥龍,白素英

    (東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱 150040)

    小鼠抗食蟹猴IgG單克隆抗體的制備

    張段玲,張彥龍,白素英

    (東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱 150040)

    目的 制備抗食蟹猴、恒河猴等非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫球蛋白二級(jí)抗體,開(kāi)展對(duì)其傳染病血清學(xué)快速診斷方法的建立。方法 采用飽和硫酸銨鹽析、Agarose-Protein G親和層析技術(shù),從食蟹猴血清中提純 IgG。經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定,采用常規(guī)法免疫C57BL/6小鼠,三次免疫后取脾細(xì)胞與 Sp2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)PEG4000融合制備雜交瘤細(xì)胞,利用間接ELISA、Western blot等方法進(jìn)行篩選、鑒定。結(jié)果 得到5株陽(yáng)性雜交瘤,分別命名為2B6、2B7、2D9、3B2、5E4,并且5株雜交瘤分泌的抗體均與恒河猴的 IgG或血清發(fā)生交叉反應(yīng),而與其他物種如東北虎、犬等動(dòng)物的IgG或血清無(wú)交叉反應(yīng)。結(jié)論 5株雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體(McAb)具有較好免疫活性,且能長(zhǎng)期、穩(wěn)定地分泌抗體。此項(xiàng)研究工作為后續(xù)研究食蟹猴、恒河猴傳染病血清學(xué)診斷方法奠定基礎(chǔ)。

    食蟹猴;IgG;單克隆抗體;親和層析

    食蟹猴(Macaca fascicularis)屬于靈長(zhǎng)目(primates)猴科(Cercopithecidae)獼猴屬?,F(xiàn)階段我國(guó)養(yǎng)殖的實(shí)驗(yàn)猴主要是獼猴屬的食蟹猴和恒河猴,其中食蟹猴為外來(lái)種,兩者均被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約(CITES)》附錄Ⅱ中[1]。獼猴屬動(dòng)物親緣關(guān)系上和人類比較接近,與人類遺傳物質(zhì)有75%~98.5%的同源性,是研究人類疾病的理想動(dòng)物模型,被廣泛的應(yīng)用于傳染病、遺傳性疾病、心血管疾病、內(nèi)分泌疾病、藥理學(xué)和毒理學(xué)等研究領(lǐng)域[2-4]。但是食蟹猴及其他非人類靈長(zhǎng)類患病種類繁多,如 B病毒、猴痘、猴結(jié)核、猴副流感、麻疹病毒病、肝炎病毒病等[5-8]。因此需要建立相應(yīng)的診斷方法,以便對(duì)所用實(shí)驗(yàn)猴進(jìn)行徹底的檢查,排除疾病個(gè)體。目前我國(guó)雖然已建立一些診斷方法,但仍沒(méi)有一個(gè)完善的方法滿足實(shí)驗(yàn)猴疾病的排查和篩選,血清學(xué)方法是診斷疾病的有效手段之一,制備抗免疫球蛋白二級(jí)抗體是開(kāi)展血清學(xué)診斷研究工作的前提。

    本文針對(duì)食蟹猴IgG制備其單克隆抗體,并鑒定此抗體與恒河猴免疫球蛋白抗原相關(guān)性,為以后開(kāi)展非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物疾病血清學(xué)診斷方法及診斷試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 食蟹猴血清、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    食蟹猴血清由東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)植物檢測(cè)中心白素英老師惠贈(zèng)[SCXK(瓊)2004-0001]。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)室保存。C57BL/6小鼠,購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤防治研究所[SCXK(黑)2005-2007]。

    1.2 試劑

    鑒定 McAb 的亞型診斷試劑盒為SBA ClonotypingTMSystem/HRP,SouthernBiotech,Cat.No.5300-05;RPMI-1640 培 養(yǎng) 基,GIBCO,Cat.No.3180022;HATMediaSupplement(50×)Hybri-MaxTM,Sigma,Cat.No.H0262;HT Media Supplement(50 × )Hybri-MaxTM Sigma,Cat.No H0137;Anti-Mouse IgG,Sigma,Cat.No A4416;Freund’s complete adjuvant(FCA)Sigma, Cat. No. F5881;OPhenylenediaminedihydrochloride(OPD),Sigma,Cat.No P9187。

    1.3 IgG制備及純度鑒定

    采用飽和硫酸銨鹽析和Agarose-Protein G親和層析分離純化,按文獻(xiàn)[9]的方法,取10 mL食蟹猴血清和40 mL冷的50 mmol/L PBS(pH7.2)緩沖液,在冰上加入硫酸銨粉末,邊加邊攪拌,最終濃度在22%,離心去除沉淀,上清液繼續(xù)加入硫酸銨粉末終濃度55%,在4℃下放置4 h,離心回收沉淀,并溶解在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中,透析在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中,中間三次換液并過(guò)夜透析。次日回收透析液,離心除去不溶物。上清液加入硫酸銨粉末至終濃度33%,在4℃下攪拌并靜止4 h,離心收集沉淀,透析于20 mmol/L磷酸鹽中,換液3次并過(guò)夜,回收透析液,并12000 rpm離心10 min,去掉不溶性蛋白備用。層析法是將Agarose-PreoteinG在超純水中膨脹30~60 min后裝柱,經(jīng)5~10倍體積的20 mmol/L磷酸鹽平衡后,上柱、洗脫,并收集洗脫液定量。用SDS-PAGE對(duì)提純的IgG純度進(jìn)行鑒定,純化后的IgG-80℃保存。

    1.4 小鼠免疫及細(xì)胞融合

    取6~8周齡雌性 C57BL/6小鼠,初次免疫為FCA乳化抗原,皮下多點(diǎn)注射,抗原用量為250 ug/只,間隔2周,進(jìn)行FIA加強(qiáng)免疫1次,第3次用純化的IgG腹腔直接免疫,4 d后取脾臟,分離細(xì)胞,骨髓瘤細(xì)胞1×107個(gè)/mL與已免疫的小鼠脾細(xì)胞1×108個(gè)/mL混合,用 50%的 PEG4000/RMPI-1640進(jìn)行融合制備雜交瘤。

    1.5 雜交瘤細(xì)胞的篩選

    按常規(guī)間接ELISA方法,融合10 d后,以100 ng/孔純化后的食蟹猴IgG作檢測(cè)抗原包被ELISA板,3%BSA封閉1 h,取融合細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè),并以SP2/0培養(yǎng)上清和免疫小鼠血清分別做陰陽(yáng)性對(duì)照,加二抗,顯色,ELISA讀數(shù),判定標(biāo)準(zhǔn)為P/N>2.1為陽(yáng)性。采用有限稀釋法對(duì)所選擇陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)3次克隆,3次克隆化后結(jié)果均為陽(yáng)性者,判斷為能穩(wěn)定分泌抗食蟹猴IgG抗體的雜交瘤細(xì)胞株。擴(kuò)大培養(yǎng)并分批凍存雜交瘤細(xì)胞。

    1.6 單克隆抗體(McAb)的免疫原性檢測(cè)

    McAb的免疫原性通過(guò)Western blot檢測(cè),取純化后及粗提的食蟹猴 IgG進(jìn)行 SDS-PAGE;通過(guò)半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上,3%BSA 37℃封閉1 h;在搖床上用 PBST洗膜5次,然后分別與雜交瘤2B6、2B7、2D9、3B2、5E4上清 37 ℃ 作用 1 h,清洗;再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 37℃作用1 h,清洗;ECL-Kit顯色后,立即暗室曝光、洗相。

    1.7 McAb腹水制備及效價(jià)的測(cè)定

    按照常規(guī)方法,選8~10周齡 C57BL/6小鼠腹腔每只注射0.5 mL液體石蠟。7 d后,以1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞/mL,0.5 mL每只小鼠,腹腔注射。一般7~10 d左右,便可以采集腹水。取得腹水后,腹水經(jīng)離心、硫酸銨沉淀、Protein G-Agarose親合層析純化得到純度較高的單克隆抗體。然后通過(guò)間接ELISA方法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定,100ng/孔包被食蟹猴IgG,方法同雜交瘤細(xì)胞的篩選。

    1.8 McAb特異性鑒定

    通過(guò)間接ELISA,以犬血清、貉血清、東北虎血清、恒河猴血清各50 uL/孔以及純化后的 IgG各100 ng/孔作為抗原包被酶標(biāo)板,以雜交瘤培養(yǎng)上清為一抗,方法同雜交瘤細(xì)胞的篩選。同時(shí)以純化后的犬、貉、東北虎、獼猴免疫球蛋白,通過(guò) SDS-PAGE電泳與 Western blot鑒定 MAb的特異性,方法同McAb的免疫原性檢測(cè)。

    1.9 McAb亞型鑒定

    單克隆抗體的亞型的鑒定,參照 SBA ClonotypingTMSystem/HRP說(shuō)明書(shū)所描述方法進(jìn)行操作。

    2 結(jié)果

    2.1 SDS-PAGE鑒定IgG

    經(jīng)飽和硫酸銨沉淀得粗提食蟹猴IgG和經(jīng)Protein G-Agarose親和層析后食蟹猴IgG通過(guò)SDSPAGE電泳后,結(jié)果如圖1所示,重鏈的分子量約55×103,輕鏈約28×103,符合哺乳動(dòng)物的 IgG的分子量。

    2.2 McAb免疫活性檢測(cè)

    采用Western blot法檢測(cè)5株單克隆抗體與粗提、純化后的食蟹猴 IgG的結(jié)合活性,結(jié)果表明2B6、5E4、2B7、2D9、3B2均與重鏈反應(yīng),5 株雜交瘤均具有良好的免疫活性。

    圖1 SDS-PAGE IgG鑒定Fig.1 SDS-PAGE identify the IgG

    2.3 McAb腹水效價(jià)

    小鼠腹水經(jīng)純化后,2D9、3B2的腹水效價(jià)分別為 1∶25600,1∶51200。2B7、5E4、2B6的 ELISA 效價(jià)為1∶12800,雜交瘤細(xì)胞經(jīng)多次傳代凍存復(fù)蘇,誘生腹水抗體分泌特性穩(wěn)定。

    2.4 McAb特異性鑒定

    McAb與純化后的食蟹猴、恒河猴 IgG,食蟹猴血清、恒河猴血清均反應(yīng),而與東北虎、犬的血清及其IgG均不反應(yīng)。說(shuō)明食蟹猴與恒河猴IgG具有相同的抗原表位,如表1可見(jiàn)。

    2.5 McAb亞型鑒定

    用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒測(cè)定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中單克隆抗體的亞型,結(jié)果表明5E4、2B6、2B7為 IgG2b 型,3B2為 IgG3 型,2D9為 IgG1 型。2B7、2B6、5E4、2D9輕鏈均為 κ 型,3B2 為 λ 型。

    表1 ELISA鑒定結(jié)果Tab.1 Result of ELISA evaluation

    3 討論

    據(jù)2009年統(tǒng)計(jì),我國(guó)實(shí)驗(yàn)猴的存欄量21萬(wàn)只,其中恒河猴近3萬(wàn)只,食蟹猴18萬(wàn)余只[11]。食蟹猴、恒河猴因與人類有很近的親源關(guān)系,遺傳基因相似,廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)研究,是重要的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P?,但是由于攜帶多種疾病,因此需要加強(qiáng)非人靈長(zhǎng)類的疾病檢測(cè),保證實(shí)驗(yàn)順利開(kāi)展至關(guān)重要。

    為此,從食蟹猴血清中,通過(guò)飽和硫酸銨沉淀和親和層析技術(shù),由SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明所得到的食蟹猴IgG純度較高。雖然粗提條帶相對(duì)于親和層析有少量雜帶,但其純度仍相當(dāng)客觀,所以在需要制備大量粗提抗體時(shí),加入固體飽和硫酸銨沉淀法從儀器設(shè)備、溫度、價(jià)格、活性、純度等方面考慮,有很大優(yōu)勢(shì),值得推廣使用。而親和層析法相對(duì)于其他提純方法價(jià)格雖比較昂貴,但其可以在簡(jiǎn)單的試驗(yàn)條件里,快速得到所需高純度樣品。二者聯(lián)合運(yùn)用,即經(jīng)濟(jì),效果也客觀,在制備各種動(dòng)物免疫球蛋白二級(jí)抗體方面,可優(yōu)先考慮。

    本研究利用細(xì)胞融合技術(shù),成功制備了5株能穩(wěn)定分泌抗食蟹猴IgG的雜交瘤細(xì)胞。從單克隆特異性鑒定結(jié)果表明,每孔均包被100 ng純化后的IgG,這5株雜交瘤所分泌單克隆抗體均與食蟹猴、恒河猴純化后的IgG、血清反應(yīng),差別是血清反應(yīng)性較純化的IgG弱些,有可能跟血清中IgG相對(duì)濃度比純化后的濃度低有關(guān)。食蟹猴、恒河猴兩個(gè)物種的反應(yīng)強(qiáng)度相似,說(shuō)明食蟹猴、恒河猴IgG具有較高的共同抗原表位。這可能與它們親緣關(guān)系較近有關(guān)。單克隆抗體為以后研究這兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病血清學(xué)診斷、人IgG特性比對(duì),提供了基礎(chǔ)。

    [1]曾峰波,宋慧剛.中國(guó)實(shí)驗(yàn)猴養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策初探[J].野生動(dòng)物雜志,2007,28(3):58 -59.

    [2]方喜業(yè).醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1995:153-155.

    [3]Martin Ebeling,Erich Küng,Angela See,et al.Genome-based analysis of the nonhuman primate Macaca fascicularis as a model for drug safety assessment[J].Genome Research,2011,21:1746-1756.

    [4]Robert B Norgren.Creation of non-human primate neurogenetic disease models by gene targeting and nuclear transfer[J].Reproductive Biology and Endocrinology,2004,2:40.

    [5]李曉波,賀爭(zhēng)鳴.猴B病毒檢測(cè)技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2007,24(4):59 -62.

    [6]張正,岳志紅.猴痘病毒研究進(jìn)展[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2003,26(8):511 -514

    [7]Murray E.Fowler DVM,R.Eric Miller DVM.Zoo and Wild Animal Medicine(fifth edition) [M].St.Louis:Saunders,2003:334-397.

    [8]夏咸柱,高宏偉,華育平,等.野生動(dòng)物疫病學(xué)(第一版)[M].北京:高等教育出版社,2011:585-608.

    [9]張彥龍,張潔,譚婷婷,等.蘭狐和銀黑狐免疫球蛋白的提純與鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,30(12):981 -983.

    [10]薩姆布魯克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯 T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)[M].北京:科學(xué)出版社,1995:880-885.

    [11]劉歡,白素英,李曉平,等.實(shí)驗(yàn)獼猴和食蟹猴規(guī)?;曫B(yǎng)管理[J].野生動(dòng)物,2010,31(1):3 -5.

    Preparation Monoclonal Antibodies Of Mice Against Macaca fascicularis IgG

    ZHANG Duan-ling,ZHANG Yan-long,BAI Su-ying
    (Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

    ObjectiveIn order to prepare immunoglobulin G(IgG)secondary antibody of non-human primates such as Macaca fascicularis and Macaca mulatta and establish a quick serological method to diagnose their diseases.MethodsMacaca fascicularis IgG was isolated and purified from Macaca fascicularis serum by precipitated use saturated ammonium sulfate and affinity chromatography technology with Agarose-Protein G.After identified by SDS-PAGE electrophoresis murine monoclonal antibody(McAb)were produced by conventional immune method and hybridoma technology.Monoclonal antibody was produced when C57BL/6 mice was immunized three times and its spleen cells were fused with SP2/0-Ag14 myeloma cells.Indirect ELISA and Western blot methods were used for identification.Result5 strains of myeloma cells acquired which were named 2B6,2B7,3B2,5E4,2D9.The antibodies they secret can all react well with both IgG and their serum of Macaca fascicularis and Macaca mulatta.There are no cross reaction with other species such as east-northern tigers and dogs.ConclusionThe 5 strains of monoclonal antibodies can secrete antibody chronically and steadily.The study can be valuable in establishing a quick serological method in diagnosing the infectious disease.

    Macaca fascicularis;IgG;Affinify chromatography;Monoclonal antibody

    R332

    】A

    1671-7856(2012)05-0068-04

    10.3969/j.issn.1671.7856.2012.05.015

    國(guó)家林業(yè)局疫源疫病監(jiān)測(cè)項(xiàng)目《我國(guó)境內(nèi)不同種屬猴免疫球蛋白同源性分析及其單克隆抗體的制備》。

    張段玲(1988-),女,碩士,研究方向:動(dòng)物傳染病。

    張彥龍(1968-),E-mail:zhangynlng@yahoo.com.cn。

    2012-03-23

    猜你喜歡
    食蟹雜交瘤恒河
    一起去食蟹
    關(guān)於《恒河之流》的另一種版本
    食蟹
    恒河風(fēng)情錄
    世界博覽(2019年15期)2019-08-26 08:10:55
    融化的冰床
    中外文摘(2019年10期)2019-06-17 02:13:50
    恒河靜默塵世喧囂
    伏馬菌素B1單克隆抗體的制備及免疫學(xué)檢測(cè)方法初步應(yīng)用
    恒河
    詩(shī)選刊(2016年2期)2016-05-23 09:55:42
    實(shí)驗(yàn)用食蟹猴脫毛癥病因分析及防治研究
    雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)及其注意事項(xiàng)
    国产三级中文精品| 久久久国产成人免费| 国产精品久久视频播放| 午夜视频国产福利| 精品久久久久久成人av| 韩国av在线不卡| 日本欧美国产在线视频| a级毛色黄片| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产精品国产高清国产av| 久久人人精品亚洲av| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲五月天丁香| 国产一级毛片在线| 国产午夜精品论理片| 亚洲欧美精品自产自拍| 日日撸夜夜添| 精品久久久久久久末码| 精品人妻一区二区三区麻豆| 成人特级黄色片久久久久久久| 在线观看一区二区三区| 夜夜爽天天搞| 国产av一区在线观看免费| 婷婷亚洲欧美| 日韩制服骚丝袜av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产在视频线在精品| 免费无遮挡裸体视频| 五月伊人婷婷丁香| 午夜福利在线观看吧| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 一进一出抽搐动态| kizo精华| 日韩中字成人| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产一区二区激情短视频| 国产精华一区二区三区| 欧美潮喷喷水| 国产亚洲5aaaaa淫片| 色综合站精品国产| 欧美3d第一页| 国产精品一区二区三区四区免费观看| www.色视频.com| 色播亚洲综合网| 精品久久久久久成人av| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 美女黄网站色视频| 性色avwww在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| av福利片在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产精品久久视频播放| 国产色婷婷99| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 嫩草影院新地址| 久久久国产成人精品二区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 久久久午夜欧美精品| 色综合亚洲欧美另类图片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品久久久久久成人av| 久久精品91蜜桃| 爱豆传媒免费全集在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | h日本视频在线播放| 色噜噜av男人的天堂激情| 黄色视频,在线免费观看| 国产中年淑女户外野战色| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产三级在线视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 中文字幕制服av| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产av在哪里看| 一级二级三级毛片免费看| 精品无人区乱码1区二区| 在线国产一区二区在线| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 乱人视频在线观看| 极品教师在线视频| 在线天堂最新版资源| 久久久成人免费电影| 一区二区三区免费毛片| 极品教师在线视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 秋霞在线观看毛片| 亚洲国产精品合色在线| 久久久久久久久大av| 97热精品久久久久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 99热这里只有是精品50| 男的添女的下面高潮视频| 精品午夜福利在线看| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲成av人片在线播放无| 国产精品福利在线免费观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产真实伦视频高清在线观看| 九九热线精品视视频播放| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产亚洲精品av在线| 哪个播放器可以免费观看大片| 99九九线精品视频在线观看视频| 久久精品久久久久久久性| 麻豆成人av视频| av在线观看视频网站免费| 午夜亚洲福利在线播放| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 岛国在线免费视频观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产成人a∨麻豆精品| 一本久久精品| 午夜免费男女啪啪视频观看| 精华霜和精华液先用哪个| av视频在线观看入口| 高清在线视频一区二区三区 | 自拍偷自拍亚洲精品老妇| а√天堂www在线а√下载| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久精品人妻少妇| 99国产精品一区二区蜜桃av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日韩av不卡免费在线播放| 激情 狠狠 欧美| 国产v大片淫在线免费观看| 看十八女毛片水多多多| 床上黄色一级片| 久久精品国产亚洲网站| 黄色日韩在线| 欧美性猛交黑人性爽| 免费在线观看成人毛片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产黄a三级三级三级人| 午夜激情欧美在线| 少妇高潮的动态图| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 内地一区二区视频在线| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 最近手机中文字幕大全| 国产亚洲精品av在线| 国产不卡一卡二| 一级毛片我不卡| 免费观看精品视频网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 观看免费一级毛片| 国产三级在线视频| 能在线免费看毛片的网站| 国产探花在线观看一区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 插阴视频在线观看视频| 最近视频中文字幕2019在线8| a级一级毛片免费在线观看| 身体一侧抽搐| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 日韩视频在线欧美| 深夜a级毛片| videossex国产| 成人综合一区亚洲| 久久国产乱子免费精品| 亚洲国产精品成人久久小说 | 久久久久九九精品影院| 久久久久久久久久成人| 久久人人爽人人爽人人片va| 欧美另类亚洲清纯唯美| ponron亚洲| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产高清三级在线| 久久精品国产自在天天线| 久久久色成人| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲18禁久久av| 国产视频内射| 波野结衣二区三区在线| 久久久久久久午夜电影| 人妻久久中文字幕网| 日本-黄色视频高清免费观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国内精品一区二区在线观看| 深夜精品福利| 亚洲不卡免费看| 国产高潮美女av| 一夜夜www| 精品久久久久久久久久免费视频| 日韩中字成人| 日韩一区二区三区影片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日本av手机在线免费观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲欧洲国产日韩| 久久99热6这里只有精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 久久人妻av系列| 国产爱豆传媒在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 18+在线观看网站| 草草在线视频免费看| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产一区二区在线av高清观看| 又爽又黄无遮挡网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜福利在线在线| 亚洲四区av| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 性色avwww在线观看| 国产成人一区二区在线| 亚洲国产欧美人成| 又爽又黄a免费视频| 日日啪夜夜撸| 1024手机看黄色片| 在线观看66精品国产| 激情 狠狠 欧美| 国产 一区 欧美 日韩| 蜜臀久久99精品久久宅男| 最近手机中文字幕大全| 黄色日韩在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产激情偷乱视频一区二区| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 黄色欧美视频在线观看| 国产成人91sexporn| 久久精品国产亚洲网站| 22中文网久久字幕| 国产精华一区二区三区| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 综合色av麻豆| 天堂网av新在线| 91aial.com中文字幕在线观看| 春色校园在线视频观看| 国产在线男女| 亚洲av免费在线观看| 91精品国产九色| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲五月天丁香| 国产成人一区二区在线| 精品久久久久久久久av| 真实男女啪啪啪动态图| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 热99re8久久精品国产| 99视频精品全部免费 在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲av.av天堂| 久久草成人影院| 日本免费一区二区三区高清不卡| 毛片女人毛片| 日本成人三级电影网站| 在线观看美女被高潮喷水网站| 黄色欧美视频在线观看| 亚州av有码| 亚洲美女搞黄在线观看| 日韩欧美 国产精品| 国产精品三级大全| 国产精品伦人一区二区| kizo精华| 少妇丰满av| 久久午夜福利片| 高清在线视频一区二区三区 | 青春草视频在线免费观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 麻豆国产av国片精品| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久午夜欧美精品| 欧美日韩乱码在线| 校园春色视频在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 99久久中文字幕三级久久日本| 久99久视频精品免费| 国产成人午夜福利电影在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 在线观看一区二区三区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| av天堂在线播放| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 22中文网久久字幕| 简卡轻食公司| 久久久久久九九精品二区国产| 男人的好看免费观看在线视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲av一区综合| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久久久久久久大av| 中文字幕制服av| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲av熟女| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲美女视频黄频| 国产美女午夜福利| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲成av人片在线播放无| 精品久久久久久久久av| 免费人成在线观看视频色| 国产精品一及| 亚洲国产精品国产精品| 色综合亚洲欧美另类图片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美日韩在线观看h| 一进一出抽搐动态| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩亚洲欧美综合| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲av一区综合| 91精品一卡2卡3卡4卡| 97在线视频观看| 黄色欧美视频在线观看| 国产av不卡久久| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 热99在线观看视频| 成年av动漫网址| 日韩中字成人| 国产91av在线免费观看| 在线观看一区二区三区| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲自拍偷在线| 99热这里只有是精品在线观看| 国产三级中文精品| 少妇熟女欧美另类| av天堂在线播放| 午夜激情福利司机影院| 日韩人妻高清精品专区| 国产麻豆成人av免费视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 男插女下体视频免费在线播放| 小说图片视频综合网站| 春色校园在线视频观看| 国产精品一区二区性色av| 久久九九热精品免费| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美日韩综合久久久久久| 久久午夜福利片| 免费av不卡在线播放| 国产精品久久久久久av不卡| 日本成人三级电影网站| 男插女下体视频免费在线播放| 国产熟女欧美一区二区| 精品欧美国产一区二区三| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 国产日韩欧美在线精品| 国产精品一及| 亚洲人成网站高清观看| 深夜精品福利| 国内精品久久久久精免费| 国产成年人精品一区二区| 男女那种视频在线观看| 国产精品,欧美在线| 午夜久久久久精精品| 免费电影在线观看免费观看| 国产成人a区在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 日本在线视频免费播放| 99热只有精品国产| 日韩欧美国产在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 麻豆一二三区av精品| 淫秽高清视频在线观看| 搞女人的毛片| 成人午夜高清在线视频| 欧美最新免费一区二区三区| 一本久久精品| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品一区www在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲欧美成人精品一区二区| 免费大片18禁| 久久久久久久久久久免费av| 久久午夜福利片| 在线天堂最新版资源| 99久国产av精品国产电影| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产精品一区二区三区四区久久| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久久久久久午夜电影| 欧美人与善性xxx| av视频在线观看入口| 亚洲色图av天堂| 一级毛片我不卡| 国产一级毛片七仙女欲春2| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美一区二区精品小视频在线| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲av中文av极速乱| 色视频www国产| 亚洲精品成人久久久久久| 中文字幕免费在线视频6| 成人国产麻豆网| 中文在线观看免费www的网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 免费观看的影片在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 国产69精品久久久久777片| 搞女人的毛片| 中国美女看黄片| 国产成人精品久久久久久| 国内精品宾馆在线| 国产一级毛片七仙女欲春2| 成人性生交大片免费视频hd| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 晚上一个人看的免费电影| 久久亚洲精品不卡| 午夜精品一区二区三区免费看| 97在线视频观看| 亚洲性久久影院| 欧美激情在线99| 在线观看免费视频日本深夜| 麻豆国产av国片精品| 欧美又色又爽又黄视频| 久久精品久久久久久久性| 国产不卡一卡二| 午夜久久久久精精品| АⅤ资源中文在线天堂| 国产精品野战在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 久久久久久久久中文| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲在线自拍视频| 亚洲av成人av| 成人欧美大片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 色综合色国产| 给我免费播放毛片高清在线观看| 全区人妻精品视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 免费观看a级毛片全部| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲综合色惰| 国产日韩欧美在线精品| 淫秽高清视频在线观看| 伦理电影大哥的女人| 一本久久中文字幕| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 免费看日本二区| 99久久精品热视频| 午夜精品一区二区三区免费看| a级毛片a级免费在线| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产亚洲精品久久久com| 12—13女人毛片做爰片一| 色视频www国产| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 有码 亚洲区| 搞女人的毛片| 春色校园在线视频观看| av天堂在线播放| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产亚洲91精品色在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 六月丁香七月| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产私拍福利视频在线观看| 在线国产一区二区在线| 男女视频在线观看网站免费| 边亲边吃奶的免费视频| 婷婷色av中文字幕| 日日撸夜夜添| 欧美高清成人免费视频www| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 欧美丝袜亚洲另类| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成人美女网站在线观看视频| 舔av片在线| 三级经典国产精品| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲av中文av极速乱| 国产91av在线免费观看| 哪里可以看免费的av片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲最大成人手机在线| 免费看a级黄色片| 尤物成人国产欧美一区二区三区| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久久久网色| 深夜a级毛片| 真实男女啪啪啪动态图| 免费看美女性在线毛片视频| 国产高清不卡午夜福利| 一级黄片播放器| 男女下面进入的视频免费午夜| 精品久久久噜噜| 日本免费a在线| 小说图片视频综合网站| 麻豆乱淫一区二区| 高清日韩中文字幕在线| 日韩欧美在线乱码| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲av中文av极速乱| 国产精品永久免费网站| a级毛片a级免费在线| av福利片在线观看| 久久久久性生活片| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 一区二区三区免费毛片| 蜜臀久久99精品久久宅男| 精品人妻一区二区三区麻豆| a级毛片a级免费在线| 夫妻性生交免费视频一级片| 51国产日韩欧美| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产av麻豆久久久久久久| 免费搜索国产男女视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美一区二区国产精品久久精品| h日本视频在线播放| 久久精品夜色国产| 99热网站在线观看| kizo精华| 春色校园在线视频观看| 国产 一区精品| 日韩大尺度精品在线看网址| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日韩欧美 国产精品| 亚洲人成网站在线播| 精品久久久久久久久av| 一个人看的www免费观看视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 在线国产一区二区在线| 亚洲精品国产av成人精品| 日韩欧美精品v在线| 日本一本二区三区精品| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产精品一区二区性色av| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久久精品94久久精品| 国产精品1区2区在线观看.| 麻豆乱淫一区二区| 黑人高潮一二区| 日本熟妇午夜| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲精品成人久久久久久| av专区在线播放| 中国美女看黄片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 噜噜噜噜噜久久久久久91| av.在线天堂| 一级av片app| 九色成人免费人妻av| 白带黄色成豆腐渣| 国产日本99.免费观看| 国产精品人妻久久久影院| 婷婷亚洲欧美| 久久久久性生活片| 国产精品一区二区三区四区久久| 大香蕉久久网| 日韩一区二区三区影片| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 看十八女毛片水多多多| 青春草国产在线视频 | 九九爱精品视频在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 九九在线视频观看精品| 国产精品久久久久久久久免| 一级毛片电影观看 | av天堂在线播放| 精品久久久噜噜| 六月丁香七月| 此物有八面人人有两片| 男女那种视频在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产极品天堂在线| 老女人水多毛片| 日本爱情动作片www.在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 国产在视频线在精品| 免费大片18禁| 久久热精品热| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 91久久精品国产一区二区成人|