兩種人乳腺癌裸鼠移植模型的建立

饒子亮，黃 威，鄭佳琳，孫 俠，黃紅坤，鐘志勇，王 剛

（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，佛山 528248）

乳腺癌是一種嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢，居?jì)D女惡性腫瘤的首位或第2位［1］。在對其生物學(xué)行為的認(rèn)識及發(fā)展新的治療方法上，乳腺癌動物模型起著舉足輕重的作用［2-4］。在實(shí)踐中人們發(fā)現(xiàn)，由于乳腺癌細(xì)胞株自身的生物學(xué)特性所限，很多人乳腺癌細(xì)胞株在小鼠模型上成瘤率很低，大大影響了建模的穩(wěn)定性和可靠性［5］。目前國內(nèi)報(bào)道的乳腺癌模型多數(shù)來源于動物或者需要手術(shù)，且缺少對人源性乳腺癌模型制作的報(bào)道。本研究的目的是建立簡便的人乳腺癌裸鼠移植模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與飼養(yǎng)條件

SPF級BALB/c裸鼠20只，雌性，周齡5～6周，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供［SCXK（粵） 2008-0002］。裸鼠飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級實(shí)驗(yàn)動物室IVC系統(tǒng)內(nèi)，動物實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施合格證號：SYXK（粵）2008-0002，室內(nèi)保持20～25℃，濕度40～70％，自由飲水、進(jìn)食，水料充足，SPF級飼料產(chǎn)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 細(xì)胞

MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞來源于中科院上海細(xì)胞庫。

1.3 主要試劑和儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基，GIBCO公司生產(chǎn)，批號：8110164；胎牛血清：GIBCO公司生產(chǎn)，批號：20091031：青/鏈霉素雙抗，杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號：10081201；胰酶，杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號：10210302。

倒置顯微鏡，日本奧林巴斯產(chǎn)品，型號：CKX41；無菌超凈臺，蘇州凈化有限公司，型號：SW-CJ-2FD；恒溫CO2孵箱，美國Thermo，型號：311。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取對數(shù)生長期的MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用Hank液清洗2次，再用1％錐蟲藍(lán)染色，在細(xì)胞記數(shù)板上作細(xì)胞記數(shù)，并調(diào)節(jié)使活細(xì)胞濃度為5×107/m L，于裸鼠左側(cè)腋窩皮下下接種0.2 m L/只，各接種10只。腫瘤細(xì)胞接種后，每d觀察腫瘤生長情況，每周測量腫塊的大小。按公式V=1/2×長×寬×寬，計(jì)算腫瘤大小，并繪制生長曲線。第30天脫頸處死荷瘤鼠，皮下剝離腫瘤稱重，記錄質(zhì)地、浸潤、血供情況，觀察有無粘連，各臟器轉(zhuǎn)移狀況，將腫瘤組織置于10％的福爾馬林固定液中待檢。

1.5 病理學(xué)檢測 上述標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均運(yùn)用SPSS11.0進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，各組計(jì)算數(shù)據(jù)均采用（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠體重

裸鼠接種MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞后，體重均緩慢增長。

2.2 腫瘤生長狀況

MDA-MB-231移植瘤5 d潛伏期后，接種部位皮下可見灰白色結(jié)節(jié)，后呈圓形或橢圓形生長，自接種第7天腫瘤可測量開始，每周測量腫瘤體積大小，繪制生長曲線見圖2。腫瘤生長較緩慢，接種成功率為90％（9/10）。接種42 d后，腫瘤平均體積達(dá)到426.6 mm3，瘤重0.417 g，見表1。

SK-BR-3移植瘤11 d潛伏期后，接種部位皮下可見灰白色結(jié)節(jié)，后呈圓形或橢圓形生長，自接種第14天腫瘤可測量開始，每周測量腫瘤體積大小，繪制生長曲線見圖2。腫瘤生長緩慢，接種成功率為80％（8/10）。接種42 d后，腫瘤平均體積達(dá)到357.5mm3，瘤重0.325 g，見表1。

表1 42 d乳腺癌裸鼠移植瘤體積和重量Tab.1 42 d Tumor volume and Weight in the breast tumor-bearing nudemice

2.3 尸檢結(jié)果

圖2 移植瘤生長曲線Fig.2 Growth curve of the transplanted tumors

肉眼觀查，兩種腫瘤呈橢圓形包塊，包膜完整，中等硬度，切面呈灰白色。除個別有局部浸潤外，大多與周圍組織分界清楚，較易剝離，未見腹水生成及組織粘連，各臟器表面光滑，未見結(jié)節(jié)。

2.4 病理檢查結(jié)果

MDA-MB-231細(xì)胞株移植瘤組織，鏡下見腫瘤細(xì)胞呈不規(guī)則的團(tuán)塊狀及片狀分布，分化程度低，腫瘤細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，細(xì)胞核大，核異型性明顯，易見核分裂象。9例組織中，4例見壞死面積占切片總面積的5％～25％，記1分；5例見壞死面積占切片總面積的25％～50％，記2分。（彩插1圖5） SK-BR-3細(xì)胞株移植瘤組織，鏡下見腫瘤細(xì)胞呈不規(guī)則的團(tuán)塊狀及片狀分布，分化程度低，腫瘤細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，細(xì)胞核大，核異型性明顯，易見核分裂象。8例組織中（A1-4）均見壞死面積占切片總面積的25％～50％，記2分。（彩插1圖6）

3 討論

小鼠模型一直是乳腺癌醫(yī)學(xué)研究的一個重要基礎(chǔ)，乳腺癌細(xì)胞的成瘤是建模的一個關(guān)鍵部分。然而，受某些生物學(xué)特性的影響，很多乳腺癌細(xì)胞株在小鼠模型上的成瘤率往往較低。一些研究在體外實(shí)驗(yàn)向體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的過渡中，往往因此而增加工作量，甚至受到阻礙［6，7］。有學(xué)者推測，小鼠體內(nèi)的雌激素水平遠(yuǎn)低于人類是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要原因，由此需通過各種方法向?qū)嶒?yàn)鼠體內(nèi)輸入雌激素。但多數(shù)給藥方法如灌胃或注射，操作重復(fù)繁瑣，且不符合生理，劑量難以掌握，以至于收效甚微。更重要的是，極為頻繁的給藥操作對小鼠造成了很大的傷害和擾動，將干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最為成功的皮下埋植緩釋劑因價(jià)格過于昂貴和起效時(shí)間達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求而應(yīng)用受到限制。值得注意的是，雌激素水平只是眾多干擾因素的一種，不能解釋所有細(xì)胞株的問題。

本研究結(jié)果顯示：腫瘤細(xì)胞移植后，荷瘤裸小鼠在SPF級環(huán)境IVC系統(tǒng)中存活、生長良好，易于飼養(yǎng)。皮下移植方法簡單，易于操作，成功率較高，MDA-MB-231達(dá)到90％（9/10），SK-BR-3達(dá)到80％（8/10）。腫瘤生長情況易于觀察。腫塊切除后行病理學(xué)切片檢查擬診為浸潤性導(dǎo)管癌，說明移植的腫瘤細(xì)胞保持了人乳腺癌腫瘤細(xì)胞的部分病理學(xué)特點(diǎn)及生物學(xué)特性，為臨床治療及療效判斷提供了可靠的工具。實(shí)驗(yàn)過程中觀察到，腫瘤細(xì)胞移植后1周左右，即有腫瘤存活生長征象，并逐漸長大，腫瘤生長緩慢。由于腫瘤生長在皮下，非常容易觀察實(shí)驗(yàn)藥物的療效及腫瘤大小的變化，可用于乳腺癌生長觀察及藥物的療效研究。

為了提高腫瘤的接種成功率應(yīng)注意以下幾個方面：①裸鼠周齡控制在5-6周，最好飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境IVC系統(tǒng)內(nèi)。②細(xì)胞狀態(tài)要好，生長旺盛，無污染；接種時(shí)要取對數(shù)生長期細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)要＞95％。③要確保細(xì)胞數(shù)量，本實(shí)驗(yàn)使用的是1× 108/m L，可多次計(jì)數(shù)然后取均值確保計(jì)數(shù)準(zhǔn)確。④皮下接種時(shí)，以近頭側(cè)成功率高，且以腋窩為佳［8］。⑤注射器抽吸瘤細(xì)胞懸液時(shí)要混勻，注射時(shí)要使細(xì)胞積聚成團(tuán)在皮下形成皮丘，抽針后要夾針孔防外溢。⑥進(jìn)行批量接種時(shí)應(yīng)在1 h內(nèi)注射完畢，時(shí)間過長腫瘤細(xì)胞易死亡，導(dǎo)致接種失?。?］。

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