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    一種新的大鼠隱睪模型的建立

    2012-02-03 07:38:56郝喜娟楊佳佳王宏蕾胡素敏
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2012年5期
    關(guān)鍵詞:隱睪生精附睪

    朱 斌,傅 騫,郝喜娟,楊佳佳,王宏蕾,朱 牧,胡素敏

    (1北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京 100029;2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,北京 100021)

    隱睪癥是指睪丸下降異常,使睪丸不能降至陰囊而停留在腹膜后腹股溝管或陰囊入口處。隱睪癥是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的先天性畸形,也是成年男性生育力低下甚至不育的主要原因之一,約5%~10%的男性不育患者有隱睪史[1]。動物隱睪模型能夠完全模擬先天性的隱睪癥,是研究人的隱睪癥的很好工具[2]。傳統(tǒng)大鼠隱睪模型,操作繁瑣,動物容易發(fā)生感染。本課題組前期在應(yīng)用尾吊模型研究失重性骨質(zhì)疏松的研究過程中發(fā)現(xiàn),3周尾吊可以引起大鼠睪丸完全滑入腹腔并造成睪丸和附睪的嚴(yán)重萎縮,可以作為無創(chuàng)模擬大鼠隱睪癥的模型。因此在本次實(shí)驗(yàn)中,筆者擬通過3周尾吊來造成大鼠隱睪,并通過8周的解懸吊恢復(fù)來觀察該模型的穩(wěn)定性。

    1 方法

    1.1 動物及分組

    W istar大鼠,雄性,28只,體重(150±10)g,鼠齡6~7周,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物公司提供,動物合格證號:SCXK(京)2006-009。所有大鼠均飼養(yǎng)在北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房內(nèi)(許可證號:SYXK (京)2011-0024),室內(nèi)相對溫度(25±1)℃,相對濕度(60±10)%,保持12 h光照/12 h黑暗交替。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,根據(jù)體重按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)將大鼠分為對照組(Ctrl)和模型組(Modl),每組14只。所有大鼠均采用懸吊籠單籠飼養(yǎng)。對照組大鼠始終在懸吊籠內(nèi)自由活動,模型組尾懸吊3周后解除懸吊,并自由恢復(fù)8周。實(shí)驗(yàn)觀察周期共11周。

    1.2 造模方法

    大鼠尾部無水乙醇脫脂,吹干。以醫(yī)用膠布從尾根部沿一側(cè)面向遠(yuǎn)端形成半環(huán),勾掛于懸吊籠橫梁所連的鉸鏈上。調(diào)整高度使鼠前肢承重,后肢懸空去負(fù)荷,鼠體與水平成30°角;大鼠可360°活動,自由覓食飲水[3]。

    1.3 取材及測量指標(biāo)

    3周后兩組大鼠解除懸吊,每組隨機(jī)挑選7只,以10%水合氯醛350 mg/kg體重麻醉大鼠,迅速剝?nèi)∑渥髠?cè)睪丸和附睪,稱重后將睪丸和附睪尾置于Boin氏固定液中,12 h后進(jìn)行修塊后,繼續(xù)固定12 h,常規(guī)包埋,脫水。6μm切片(Leica RM2235切片機(jī)),HE染色,常規(guī)光鏡觀察組織結(jié)構(gòu)改變(OLYMPUS-DP71)。8周后處死其余全部大鼠,取材、標(biāo)本處理、及檢測指標(biāo)同前。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠睪丸和附睪肉眼觀改變情況

    模型組大鼠經(jīng)3周尾部懸吊后,肉眼觀察可見其雙側(cè)睪丸全部滑回腹腔,剝離出的睪丸直徑明顯縮短,形態(tài)小于正常對照組,而附睪長度則無明顯變化。解懸吊自由恢復(fù)8周后,模型組大鼠的睪丸和附睪仍停留在腹腔,大小、形態(tài)無明顯改善(彩插10圖1)。

    2.2 大鼠睪丸及附睪重量改變情況

    模型組大鼠經(jīng)3周尾吊,和對照組相比,睪丸和附睪重量出現(xiàn)極顯著降低(P<0.01),而經(jīng)過8周的恢復(fù)后,大鼠的睪丸和附睪的重量雖有一定的增長,但仍顯著低于對照組(P<0.01)。

    2.3 大鼠睪丸和附睪HE染色

    3周尾吊后,正常大鼠的睪丸組織中生精小管排列整齊,在每一生精小管內(nèi)部管腔界限明顯,可見不同發(fā)育期初級、次級精母細(xì)胞排列整齊,管腔中可見大量未成熟的精子。附睪中也存在大量成熟精子(彩插10圖2A、B,彩插9圖3 A、B)。而模型組大鼠睪丸則出現(xiàn)極顯著萎縮,生精小管嚴(yán)重萎縮,結(jié)構(gòu)變得不規(guī)則,管腔界限模糊不清,同時(shí)失去原有各期精子細(xì)胞層次,并有核空泡化的現(xiàn)象出現(xiàn),同時(shí)生精上皮層數(shù)顯著減少,排列松散,特別是次級精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的數(shù)量減少明顯,初級精母細(xì)胞壞死脫落到管腔。附睪尾中無精子的存在(彩插10圖2 C、D,彩插9圖3 C、D);經(jīng)過8周的恢復(fù)后,對照組睪丸及附睪形態(tài)完整,管腔中存在大量精子(彩插10圖2 E、F,彩插9圖3 E、F);模型組睪丸及附睪形態(tài)未見明顯改善,睪丸形態(tài)仍未恢復(fù)正常,曲細(xì)精管內(nèi)仍然存在大量的空泡樣結(jié)構(gòu),各級精母細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)混亂,管腔中僅可見少量精原細(xì)胞存在;附睪尾中仍無成熟精子(彩插10圖2 G、H,彩插9圖3 G、H)。

    表1 尾吊3周和恢復(fù)8周后睪丸及附睪重量的改變Tab.1 The weight of testis and epididym is after 3 we eks tail-suspending and 8weeks reloading

    3 討論

    睪丸位于陰囊中,是產(chǎn)生精子和分泌雄性激素的重要器官,其功能的正常發(fā)揮有賴于陰囊提供的穩(wěn)定的外部環(huán)境。哺乳動物產(chǎn)生成熟精子的過程包括睪丸生精小管中的精子發(fā)生和附睪內(nèi)精子的成熟。精子發(fā)生對溫度變化非常敏感,該過程在比體溫低1.5~2℃的睪丸內(nèi)進(jìn)行。只有睪丸保持較低的溫度,才能保證生精小管內(nèi)正常的精子發(fā)生;睪丸溫度稍微升高,精子發(fā)生則遭受破壞。研究發(fā)現(xiàn)睪丸溫度升高時(shí)可產(chǎn)生各種應(yīng)激反應(yīng),超過一定限度時(shí)引起睪丸缺血、缺氧及代謝障礙,致使生精細(xì)胞發(fā)生凋亡[4]。哺乳類動物的睪丸位于體外的陰囊內(nèi),陰囊對溫度有特殊的調(diào)節(jié)能力,可以使睪丸內(nèi)保持精子發(fā)生所需的適宜溫度[5]。研究發(fā)現(xiàn)人陰囊的平均溫度為33.3℃[6],溫度過高或者過低都會導(dǎo)致生精細(xì)胞的受損,從而影響生殖系統(tǒng)發(fā)育。

    隱睪癥發(fā)生時(shí),睪丸不能降至陰囊而停留在腹膜后腹股溝管或陰囊入口處可以造成睪丸局部溫度升高,從而引起睪丸萎縮,生精細(xì)胞減少,精子發(fā)生過程受阻,最終導(dǎo)致男性不育。

    為尋求治療隱睪癥的有效藥物,動物隱睪模型成為常用的研究手段。傳統(tǒng)隱睪模型的建立是將大鼠睪丸脂肪墊固定在兩側(cè)腹壁雙側(cè),然后縫合腹股溝和腹部,從而避免睪丸滑出腹腔。這一手術(shù)方法較好地模擬了人隱睪癥的發(fā)生。但操作繁瑣,大鼠容易出現(xiàn)術(shù)后感染而造成死亡;同時(shí)手術(shù)也會造成睪丸和腹腔粘連較重,為取材時(shí)剝?nèi)〔G丸造成困難。

    本實(shí)驗(yàn)中采用的尾吊大鼠模型,是被廣泛應(yīng)用于地面模擬失重狀態(tài)的一種動物模型。有研究發(fā)現(xiàn)7天尾部懸吊大鼠的睪丸重量明顯減輕,血清睪酮從7.1±1.3降至3.8±0.25 ng/m L;組織形態(tài)學(xué)觀察顯示,睪丸和附睪的輸精管排列紊亂,附睪管中多核細(xì)胞明顯增多[7]。周黨俠等發(fā)現(xiàn)28天尾吊引起大鼠睪丸重量下降,生精小管萎縮,生精上皮層數(shù)減少,精子數(shù)量減少,畸形率增加,活動率減少以及血清激素紊亂等較明顯的生殖系統(tǒng)損害[8]。湯金等觀察發(fā)現(xiàn)模擬失重會使雄性大鼠生殖器官睪丸的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重的病理改變,導(dǎo)致睪丸生精上皮不可逆損傷,使睪丸組織分泌表達(dá)雄激素受體(Androgen Receptor,AR)的功能減退,引起熱休克蛋白(Heat Shock protein70,HSP70)的過量表達(dá)和大量釋放,形成細(xì)胞外熱休克蛋白(extracellular heat shock protein70,eHSP70),從而造成睪丸實(shí)質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p傷[9]。

    本實(shí)驗(yàn)中,我們也發(fā)現(xiàn),該模型會引起大鼠睪丸滑入腹腔,致使局部溫度升高,從而造成睪丸萎縮,生精細(xì)胞凋亡;而且大鼠即使在解懸吊8周后,睪丸仍停留在腹腔,結(jié)構(gòu)及功能沒有恢復(fù)。該現(xiàn)象與隱睪癥的發(fā)生有一定的相似性,且與傳統(tǒng)方法相比,采用本方法建立的大鼠隱睪模型有較為明顯的優(yōu)勢:尾吊法建立的隱睪模型可以完全避免傳統(tǒng)模型感染率、死亡率高以及腹腔粘連等缺點(diǎn),大鼠無創(chuàng)傷、無感染且穩(wěn)定性好,能有效提高實(shí)驗(yàn)的成功率。因此我們認(rèn)為,采用大鼠尾吊3周的方法,可以建立一種新的動物隱睪模型。

    [1]趙驥騰,溫海濤.單側(cè)隱睪患者精子形態(tài)學(xué)變化的研究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2008,7(14):28-29.

    [2]劉春霞,張茨,王玲瓏,等.小鼠隱睪模型制作方法的改進(jìn)[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006,27(2):200-205.

    [3]陳杰,馬進(jìn).一種模擬長期失重影響的大鼠尾部懸吊模型[J].空間科學(xué)學(xué)報(bào),1993,13(2):159-162.

    [4]郝麗榮.睪丸溫度升高對男性生殖功能的影響[J].中國男科學(xué)雜,2009,23(11):70-72.

    [5]楊國勝,費(fèi)正磊,丁德茂.生精細(xì)胞凋亡與激素調(diào)控[J].國外醫(yī)學(xué)泌尿系統(tǒng)分冊,2002,22(6):350-352.

    [6]郝麗榮.睪丸溫度升高對男性生殖功能的影響[J].中國男科學(xué)雜志,2009,23(11):70-72.

    [7]J.A.Hadley,J.C.Hall,A.O'Brien,et al.Effects of a simulated microgravity model on cell structure and function in rat testis and epididymis[J].Journal of App lied Physiology,1992,72:748-759.

    [8]周黨俠,邱曙東,王志勇,等.尾懸吊狀態(tài)對性成熟期雄性大鼠生殖功能的影響[J].中華男科學(xué)雜志,2006,12:326 -329.[9]湯金,佘銳萍,汪德生,等.模擬失重對大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)及AR和HSP70表達(dá)的影響[J].科技導(dǎo)報(bào),2008,26(19):59 -68.

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