• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    心臟特異表達(dá)腎素(原)受體轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

    2012-02-03 07:38:48馬元武全雄志張連峰
    關(guān)鍵詞:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)基因陰性

    廉 虹,馬元武,劉 寧,全雄志,張連峰

    (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

    腎素-血管緊張素系統(tǒng) (renin-angiotensin system,RAS)是控制血壓和和體內(nèi)電解質(zhì)平衡經(jīng)典的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。2002年,Nguyen等[1]利用重組的帶有放射性標(biāo)記的人源腎素,在人類腎臟cDNA庫(kù)中篩選出了一個(gè)與以往發(fā)現(xiàn)的任何膜受體蛋白均無(wú)同源性的受體蛋白,即腎素(原)受體[(p)RR]。(p) RR是一種小分子量蛋白,含有350個(gè)氨基酸,分子量35~39×103,由大段的細(xì)胞外(EC)部分,單次跨膜區(qū)(TM)和一個(gè)短的細(xì)胞內(nèi)(IC)部分組成。由于腎素(原)受體最初發(fā)現(xiàn)是與V-ATPase(囊泡H+-ATPase)偶聯(lián),所以編碼此蛋白的基因被命名為ATP6ap2(ATPase 6 accessory protein2)[2,3]。

    (p)RR在人體內(nèi)廣泛表達(dá):其中在心臟、腦、胎盤中表達(dá)最多,在肝、腎臟和胰腺中表達(dá)次之,在肺和骨骼肌組織也有少量表達(dá)。序列比對(duì)分析顯示,(p)RR在各物種間的同源性非常高,人的(p)RR與大鼠、小鼠、雞、青蛙和斑馬魚(yú)等均具有較高同源性[4],推測(cè)這個(gè)基因在生命體中具有重要的功能。在人類此基因存在于X染色體上。至今,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩種與(p)RR相關(guān)的疾病,一種是該基因的4號(hào)外顯子的剪切增強(qiáng)子發(fā)生321位C〉T的沉默突變引起神經(jīng)系統(tǒng)智力缺陷、癲癇和共濟(jì)失調(diào)等病癥[5];第二種是(p)RR基因多態(tài)性的(IVS)5+169C〉T (rs5918007)基因型與人類高血壓相關(guān)[6,7]。

    (p)RR敲除會(huì)導(dǎo)致胚胎致死,這很大程度的限制了研究者的研究進(jìn)程。隨后,Celine A等[8]構(gòu)建了血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)特異表達(dá)(p)RR的轉(zhuǎn)基因大鼠,發(fā)現(xiàn)6月齡的大鼠出現(xiàn)血壓升高、心率加快的現(xiàn)象,并且癥狀隨年齡的增加更加嚴(yán)重。在糖尿病大鼠的心臟中,(p)RR在蛋白和mRNA水平均增加三倍[9]。這些結(jié)果說(shuō)明(p)RR可能參與高血壓與糖尿病等病理過(guò)程。由于該基因在心肌中有廣泛表達(dá),我們推測(cè)它在心臟的生理功能中發(fā)揮一定的作用。因此,本文構(gòu)建了心臟特異表達(dá)(p)RR的轉(zhuǎn)基因小鼠,并初步探討了該基因?qū)π呐K功能的影響。

    1 材料和方法

    1.1 (p)RR基因的克隆和轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

    從OriGene公司購(gòu)買的帶有(p)RR cDNA的質(zhì)粒(Sc111138),通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得帶有SalI和AflII酶切位點(diǎn)的(p)RR基因cDNA目的片斷,引物序列如下Ps(SalI):5'-CCGGTCGACCACCATGGC TGTGTTTG-3';Pa(A flII):5'-CTCTACTTAAGCAT CACAGGCACACACAA-3'(由invitrogen公司合成)。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,變性94℃30s,退火62℃30s,延伸72℃2m in,共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后克隆到pMD18-T Vector,經(jīng)測(cè)序比對(duì)后,正確無(wú)突變堿基序列連入α-MHC(Genbank accession no.U_71441,clone 26)啟動(dòng)子下游,構(gòu)建心臟特異表達(dá)(p)RR的轉(zhuǎn)基因載體,經(jīng)NotⅠ將表達(dá)載體線性化,Sephedex G50柱純化,將DNA濃度調(diào)整至5 ng/μL,用顯微注射法注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中(C57BL/6J康藍(lán)公司SCXK(京)2004001),用ICR小鼠作假孕受體,制備轉(zhuǎn)基因小鼠(TE2000-U顯微注射儀)。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物福利和管理委員會(huì)的批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào):ILASGC-2010-033。

    1.2 PCR法鑒定(p)RR轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

    轉(zhuǎn)基因小鼠在出生9~14 d用剪趾法標(biāo)記,收集剪下的組織,用堿裂解法提取基因組DNA[10],用PCR法對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型檢測(cè)。αMHC-(p) RR轉(zhuǎn)基因小鼠PCR引物序列如下Ps:5' CTTTCAGTCACATTGCGGCA-3',Pa:5'-TGCGTTCCC ACCATAGAGAC-3'(由invitrogen公司合成),反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 m in,變性94℃30 s,退火59℃30 s,延伸72℃30 s,共30個(gè)循環(huán)。

    1.3 Westernblot

    用小鼠脫頸椎法,犧牲小鼠,取100 mg心臟組織加入1 m L預(yù)冷的蛋白裂解液,冰上充分研磨,之后冰上靜置30 min,再將組織勻漿于4℃,12000 r/ m in離心30 m in,吸取上清即為心臟組織總蛋白。取30μg蛋白上樣,15%的SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45μm硝酸纖維素NC膜上(Millipore,美國(guó))。5%脫脂奶粉封閉液,室溫下置搖床上封閉1 h,再用TBST稀釋的羊抗人源重組的(p)RR多克隆抗體(AF5176,R&D,美國(guó))(1∶250稀釋),4℃搖床雜交過(guò)夜。次日,待恢復(fù)室溫后,TBST洗3次,每次10 min。置入TBST稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊抗體(Pierce,美國(guó))(1∶15000),室溫雜交1 h,采用HRP-GAPDH作為內(nèi)參,TBST洗3次,每次10 min。將膜置于化學(xué)發(fā)光液中,X-Ray膠片曝光、顯影及定影。

    1.4 免疫組織化學(xué)

    選用3月齡的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性和同窩陰性小鼠心臟固定在中性福爾馬林中24 h,進(jìn)行脫水、包埋、切片,常規(guī)脫蠟入水,枸櫞酸鈉抗原熱修復(fù),待恢復(fù)室溫后3%H2O2去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,山羊血清封閉,滴加(p)RR抗體(AF5176,R&D,美國(guó))(1∶50稀釋),濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜;PBS洗3×5 min后加入兔抗山羊二抗(具體用法詳見(jiàn)二步法免疫組化試劑盒,PV-2003),PBS洗3×5 m in,DAB顯色,自來(lái)水沖洗,蘇木素復(fù)染,脫水、透明、封片,光鏡下常規(guī)觀察病理切片。

    熱修復(fù)和去除過(guò)氧化物酶的病理切片,分別滴加識(shí)別高爾基體標(biāo)志蛋白抗體:GM30(ab1299,Abcam,美國(guó))(1∶100)/識(shí)別肌漿網(wǎng)標(biāo)志蛋白抗體:PDI(ab2792,Abcam,美國(guó))(1∶100)和(p)RR抗體(ab64957,Abcam,美國(guó))(1∶25稀釋)濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜,PBS洗3×5 min后加入DyLight-標(biāo)記的抗小鼠IgG(1∶100,KPL)and A lexa 488-標(biāo)記的羊抗兔IgG (1∶100,Invitrogen)37℃孵30 min,ProLong Gold抗淬滅劑封片(Invitrogen)。制備好的病理切片利用共聚焦顯微鏡觀察分析(Leica TCS SP2,Germany).

    1.6 心臟超聲檢查

    選用3月齡的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性和同窩陰性小鼠,用三溴乙醇(0.2 m L/10g體重)麻醉,脫去心前區(qū)的被毛,選用30 Hz的探頭,按Zhou[11]報(bào)道的方法進(jìn)行心臟超聲影像分析(Vevo770小動(dòng)物超聲探測(cè)系統(tǒng),加拿大)。記錄左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole,LVID;s)等參數(shù),左室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume,LVESV),射血分?jǐn)?shù)(percent ejection fraction,EF%),短軸縮短率(percent fractional shortening,F(xiàn)S%)由計(jì)算得出。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    數(shù)據(jù)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理。先進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗(yàn),組間比較采用獨(dú)立性t檢驗(yàn)。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

    2 結(jié)果

    2.1 (p)RR轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

    用PCR法從購(gòu)買的質(zhì)粒中擴(kuò)增出人源(p)RR基因,測(cè)序結(jié)果顯示同已報(bào)道的(p)RR序列完全一致(GenBank No.NM_005765.2),將其連到α-MHC心臟特異表達(dá)的啟動(dòng)子下游,構(gòu)建α-MHC-(p)RR轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體(彩插3圖1A)。小鼠出生14 d提取基因組DNA,用PCR擴(kuò)增(p)RR基因339 bp目的片段,鑒定(p)RR轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型(彩插3圖1B),共得到4只首建鼠,且均可傳代。分別提?。╬)RR首建鼠的F1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡陰性對(duì)照小鼠心臟組織總蛋白,用(p)RR抗體進(jìn)行Western blot分析,篩選出一個(gè)高表達(dá)明顯的品系,Western blot圖譜顯示有三條目的帶,分子量大小分別約為:35×103,30×103和28×103。35×103的蛋白帶是全長(zhǎng)的(p)RR,30×103和28×103兩條蛋白帶為其截短形式[s(p)RR],從圖中我們可以看出,轉(zhuǎn)基因小鼠心臟組織內(nèi)全長(zhǎng)的(p)RR蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯增加,而兩種截短的蛋白表達(dá)量卻明顯的高于同窩陰性小鼠(彩插3圖1C)。取1月齡轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對(duì)照小鼠用(p)RR抗體進(jìn)行心臟免疫組化分析,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟中(p)RR的表達(dá)明顯高于同窩陰性對(duì)照小鼠(彩插3圖1D)。

    2.2 免疫熒光共聚焦方法進(jìn)行(p)RR亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位

    取3月齡轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對(duì)照小鼠,取出心臟制備成石蠟切片,分別用識(shí)別高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志分子的抗體與(p)RR抗體進(jìn)行雙色熒光免疫組化分析,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照小鼠的(p)RR蛋白與兩種細(xì)胞器的標(biāo)志分子能達(dá)到共定位,說(shuō)明轉(zhuǎn)基因表達(dá)的(p)RR蛋白與內(nèi)源(p)RR蛋白均存在于高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,并且可以看出轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中(p)RR蛋白的表達(dá)要明顯高于同窩陰性對(duì)照小鼠心臟中的表達(dá)(彩插4圖2A,B)。

    2.3 超聲檢查(p)RR轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟幾何構(gòu)型及心功能

    將3月齡的 (p)RR轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對(duì)照小鼠進(jìn)行心臟超聲影像分析(表1),結(jié)果顯示,與同窩陰性對(duì)照小鼠相比,(p)RR轉(zhuǎn)基因小鼠收縮期左室內(nèi)徑(LVID,systolic)降低9%(P<0.05,n= 18),收縮期容積(LVESV,systolic)減少了23%(P<0.05,n=18),射血分?jǐn)?shù)EF(ejection fraction)升高14%(P<0.01,n=18),短軸縮短率FS(fraction shortening)升高20%(P<0.01,n=18)。結(jié)果說(shuō)明,(p)RR基因的轉(zhuǎn)入增強(qiáng)了心臟的收縮性能,使心功能有了明顯的提高。

    2.4 轉(zhuǎn)基因表達(dá)(p)RR基因使轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中鈣泵、鈉-鈣交換體1表達(dá)下調(diào),肌鈣蛋白T表達(dá)上調(diào)

    提取3月齡的(p)RR轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性對(duì)照小鼠心臟組織總蛋白,進(jìn)行鈣泵(ATP2A2)、鈉-鈣交換體1(NCX 1)以及肌鈣蛋白T(cTnT)抗體的Western blot檢測(cè)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATP2A2和NCX 1表達(dá)均下調(diào),其中鈣泵表達(dá)量的降低十分顯著;而肌鈣蛋白T表達(dá)量上調(diào)(圖3)。

    3 討論

    自2002年Nguyen等[1]首次報(bào)道了人腎素(原)受體的存在之后,人們關(guān)于此受體的生物功能研究都集中在全長(zhǎng)的(p)RR形式。Cousin等[12]通過(guò)對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞(E14),大鼠平滑肌細(xì)胞(VSMC)和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)等多種細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行Western blot分析,發(fā)現(xiàn)一個(gè)28×103(p)RR低分子量形式的存在,由于這種形式的蛋白是在培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的,所以被命名為s(p)RR。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),s(p)RR是由弗林蛋白酶剪切產(chǎn)生的,而且s(p)RR存在于血漿和尿液中。不久,Yoshikawa等[13]發(fā)現(xiàn)了一種由ADAM19剪切產(chǎn)生的游離在培養(yǎng)基中一種s(p)RR形式,這兩種s(p)RR形式是否是(p)RR的同一種剪切形式以及它們各自的功能,現(xiàn)在還有待進(jìn)一步研究。本文構(gòu)建的(p)RR轉(zhuǎn)基因小鼠,除了全長(zhǎng)的(p)RR外,兩條截短的蛋白從分子量大小上看,應(yīng)該就是以上兩篇文獻(xiàn)中的所發(fā)現(xiàn)的s(p)RR,本文構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠全長(zhǎng)(p)RR蛋白沒(méi)有明顯增多而兩種s(p)RR蛋白明顯高于同窩陰性對(duì)照小鼠,這一點(diǎn)還有待進(jìn)一步解釋。這兩個(gè)獨(dú)立的研究小組[12,13]在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中也都進(jìn)行了(p)RR的亞細(xì)胞定位,結(jié)果表明(p)RR主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等細(xì)胞器中。本研究在小鼠心臟組織中進(jìn)行了(p) RR蛋白的定位研究,證實(shí)了過(guò)表達(dá)的(p)RR蛋白與內(nèi)源性的(p)RR蛋白在小鼠心臟組織中均定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上,并且轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中(p)RR蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照小鼠心臟組織。心肌細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)非常發(fā)達(dá),對(duì)鈣的儲(chǔ)存、釋放和心臟的收縮、舒張起到重要的作用,(p)RR定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上可能更有利于其參與到心肌節(jié)律性收縮舒張活動(dòng)過(guò)程中。高爾基體是將蛋白進(jìn)行加工、分類和包裝的主要場(chǎng)所,推測(cè)(p)RR的兩種s (p)RR形式在高爾基體上被剪切產(chǎn)生,并且駐留于此。

    表1 三月齡(p)RR轉(zhuǎn)基因小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能M超生分析(n=18) Tab.1 The cardiac structure and function analysis of 3-month transgenic mice by M-mode echocardiograph(n=18)

    圖3 轉(zhuǎn)基因表達(dá)(p)RR引起ATP2A2、NCX 1和cTnT蛋白表達(dá)變化Fig.3 Transgenic(p)RR leading to alter the expression level of ATP2A2/NCX 1/cTnT

    鈣離子作為興奮-收縮的偶聯(lián)介質(zhì),在維持心肌正常收縮和舒張過(guò)程中起到重要的作用。心肌細(xì)胞的收縮和舒張與細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放與儲(chǔ)存相偶聯(lián)。鈣循環(huán)主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲(chǔ)存的鈣的釋放、鈣的回?cái)z和鈣的儲(chǔ)存三個(gè)過(guò)程。位于細(xì)胞膜表面的L型鈣通道受到刺激后會(huì)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的RyR受體(ryanodine receptor)從而引起內(nèi)網(wǎng)中鈣的釋放,此時(shí)游離的鈣離子會(huì)結(jié)合肌鈣蛋白引起肌絲的滑動(dòng),使心肌產(chǎn)生收縮運(yùn)動(dòng),隨著舒張過(guò)程的開(kāi)始內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的ATP2A2逐步將細(xì)胞內(nèi)游離的鈣回收至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,同時(shí)NCX 1也將少部分的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜外??梢钥闯鲈谶@一過(guò)程中ATP2A2和NCX 1主要起到將細(xì)胞中游離的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,并且在這一過(guò)程中ATP2A2起到關(guān)鍵的作用。本文中發(fā)現(xiàn)(p)RR轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中ATP2A2和NCX 1表達(dá)量明顯降低,這顯然影響了游離鈣離子向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的回?cái)z,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度持續(xù)的維持在高濃度的狀態(tài)下,類似于鈣超載的狀態(tài),使肌鈣蛋白等鈣相關(guān)蛋白不得不繼續(xù)工作,造成心肌收縮力增強(qiáng)。同時(shí)我們檢測(cè)的肌鈣蛋白T在(p)RR轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中的表達(dá)確實(shí)也是升高的。心臟超聲結(jié)果同時(shí)顯示,(p) RR轉(zhuǎn)基因小鼠心臟心功能明顯增強(qiáng),這也是心肌收縮力增強(qiáng)的結(jié)果。

    在心臟中過(guò)表達(dá)(p)RR能夠引起心臟收縮功能明顯增強(qiáng),同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)ATP2A2、NCX 1和cTnT蛋白表達(dá)量出現(xiàn)了明顯變化,轉(zhuǎn)基因小鼠心功能增強(qiáng)。過(guò)表達(dá)的(p)RR是如何調(diào)節(jié)這些鈣離子相關(guān)蛋白的從而影響到了心臟功能,這些都有待于我們進(jìn)一步研究。不過(guò)本研究提示我們,(p)RR可能是通過(guò)調(diào)節(jié)心臟中的鈣離子從而影響心肌功能的。在接下來(lái)的的研究中,我們將從分子機(jī)制出發(fā),探求該轉(zhuǎn)基因小鼠的表型的內(nèi)在機(jī)制,更加深入的研究(p)RR在心臟中的生物學(xué)活性。

    (p)RR的發(fā)現(xiàn),為經(jīng)典的腎素-血管緊張素系統(tǒng)增添了新的內(nèi)容,使這一系統(tǒng)重新成為研究熱點(diǎn)。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(p)RR在心血管方面的重要性,關(guān)于(p)RR在心臟中發(fā)揮的生物活性還有待進(jìn)一步研究,它可能成為治療心血管疾病的重要靶點(diǎn)并且對(duì)其信號(hào)通路的研究有利于我們對(duì)一些心血管疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制的深入了解。

    [1]Nguyen G,Delarue F,Burckle C,et al.Pivotal role of the renin/ prorenin receptor in angiotensin II production and cellular responses to renin[J].J Clin Invest,2002,109(11):1417 -1427.

    [2]Burckle C and Bader M.Prorenin and its ancient receptor[J].Hypertension,2006,48(4):549-551.

    [3]L'Huillier N,Sharp,M.G.F.,Dunbar,D.R.and Mullins,J.On the relationship between the renin receptor and the vacuolar proton ATPase membrane sector associated protein(M8-M9)[J].Basic Science for the Cardiologist,2006,20:17-34.

    [4]Wakeel A,Kuriakose JA and McBride JW.An Ehrlichia chaffeensis tandem repeat protein interacts with multiple host targets involved in cell signaling,transcriptional regulation,and vesicle trafficking[J].Infect Immun,2009,77(5):1734-1745.

    [5]Ramser J,Abidi FE,Burckle CA,et al.A unique exonic splice enhancer mutation in a family with X-linked mental retardation and epilepsy points to a novel role of the renin receptor[J].Hum Mol Genet,2005,14(8):1019-1027.

    [6]Hirose T,Hashimoto M,Totsune K,et al.Association of(pro) renin receptor gene polymorphism with blood pressure in Japanese men:the Ohasama study[J].Am JHypertens,2009,22(3):294 -299.

    [7]Ott C,Schneider MP,Delles C,et al.Association of(pro)renin receptor gene polymorphism with blood pressure in Caucasian men[J].Pharmacogenet Genomics,2011,21(6):347-349.

    [8]Burckle CA,Jan Danser AH,Muller DN,et al.Elevated blood pressure and heart rate in human renin receptor transgenic rats[J].Hypertension,2006,47(3):552-556.

    [9]Connelly KA,Advani A,Kim S,et al.The cardiac(pro)renin receptor is primarily expressed in myocyte transverse tubules and is increased in experimental diabetic cardiomyopathy[J].J Hypertens,2011,29(6):1175-1184.

    [10]Truett GE,Heeger P,Mynatt RL,et al.Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT)[J].Biotechniques,2000,29(1):52,54.

    [11]Zhou YQ,F(xiàn)oster FS,Nieman BJ,et al.Comprehensive transthoracic cardiac imaging in mice using ultrasound biomicroscopy with anatomical confirmation by magnetic resonance imaging[J].Physiol Genom ics,2004,18(2):232 -244.

    [12]Cousin C,Bracquart D,Contrepas A,et al.Soluble form of the (pro)renin receptor generated by intracellular cleavage by furin is secreted in plasma[J].Hypertension,2009,53(6):1077 -1082.

    [13]Ayumu Yoshikawa YA,Ken-ichi Kusano,F(xiàn)ukuko Kishi,Teruo Susumu,Shinichiro Iida,Shoichi Ishiura,Shigeyuki Nishimura,Masayoshi Shichiri and Takaaki Senbonmatsu.The(pro)renin receptor is cleaved by ADAM19 in the Golgi leading to its secretion into extracellular space[J].Hypertension Research 2011,34:599-605.

    猜你喜歡
    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)基因陰性
    探秘轉(zhuǎn)基因
    轉(zhuǎn)基因,你吃了嗎?
    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬及其與疾病的關(guān)系研究進(jìn)展
    憤怒誘導(dǎo)大鼠肝損傷中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)
    鉬靶X線假陰性乳腺癌的MRI特征
    三陰性乳腺癌的臨床研究進(jìn)展
    LPS誘導(dǎo)大鼠肺泡上皮細(xì)胞RLE-6 TN內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡研究
    天然的轉(zhuǎn)基因天然的轉(zhuǎn)基因“工程師”及其對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的意蘊(yùn)
    hrHPV陽(yáng)性TCT陰性的婦女2年后隨訪研究
    Caspase12在糖尿病大鼠逼尿肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的表達(dá)
    老汉色∧v一级毛片| 久久久国产精品麻豆| 90打野战视频偷拍视频| 一夜夜www| 老鸭窝网址在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 男女床上黄色一级片免费看| 黄色视频不卡| 日韩欧美免费精品| 最近最新免费中文字幕在线| 成人手机av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 免费不卡黄色视频| 大码成人一级视频| 久久草成人影院| 最新美女视频免费是黄的| 久久久久久久久免费视频了| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲色图综合在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久久精品区二区三区| 黑人操中国人逼视频| 精品久久久精品久久久| 老司机亚洲免费影院| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 成人三级做爰电影| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 一级片免费观看大全| 欧美日韩一级在线毛片| 久久久久视频综合| 我的亚洲天堂| 香蕉久久夜色| 激情视频va一区二区三区| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 国产精品电影一区二区三区 | 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产成人啪精品午夜网站| 看免费av毛片| 欧美不卡视频在线免费观看 | av天堂在线播放| 国产不卡一卡二| 日韩三级视频一区二区三区| 大型av网站在线播放| 一区在线观看完整版| 大码成人一级视频| 国精品久久久久久国模美| a级毛片黄视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲中文av在线| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 成年女人毛片免费观看观看9 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 午夜福利欧美成人| 成年人免费黄色播放视频| 日本a在线网址| 后天国语完整版免费观看| 亚洲综合色网址| av国产精品久久久久影院| 老司机在亚洲福利影院| 久久久久久人人人人人| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产成人精品在线电影| 视频在线观看一区二区三区| 久久这里只有精品19| 中文字幕最新亚洲高清| 日韩免费高清中文字幕av| 精品国产亚洲在线| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 女人久久www免费人成看片| 久久精品91无色码中文字幕| 日本vs欧美在线观看视频| 精品第一国产精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 老司机靠b影院| 国产不卡一卡二| 91成年电影在线观看| 国产成人影院久久av| 欧美丝袜亚洲另类 | 丝袜在线中文字幕| 午夜福利乱码中文字幕| 久久精品人人爽人人爽视色| 十八禁人妻一区二区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 热re99久久精品国产66热6| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 岛国毛片在线播放| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品久久久久久电影网| 淫妇啪啪啪对白视频| 曰老女人黄片| 新久久久久国产一级毛片| 天堂动漫精品| 最近最新免费中文字幕在线| 首页视频小说图片口味搜索| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲一码二码三码区别大吗| 后天国语完整版免费观看| 午夜成年电影在线免费观看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 丝袜在线中文字幕| 欧美午夜高清在线| 丝袜美腿诱惑在线| 操出白浆在线播放| 搡老乐熟女国产| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 日韩欧美三级三区| 黄色视频,在线免费观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 中文字幕制服av| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲av日韩在线播放| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| xxxhd国产人妻xxx| 国产亚洲av高清不卡| av欧美777| 极品教师在线免费播放| 日本一区二区免费在线视频| 久久影院123| 女性被躁到高潮视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲五月婷婷丁香| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久久久人人人人人| 亚洲男人天堂网一区| av超薄肉色丝袜交足视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 免费观看精品视频网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 精品久久久久久,| 色94色欧美一区二区| 免费观看a级毛片全部| 正在播放国产对白刺激| 免费日韩欧美在线观看| 乱人伦中国视频| 久久久久久久午夜电影 | 女人被狂操c到高潮| 91在线观看av| 99久久人妻综合| 亚洲精品粉嫩美女一区| 天天添夜夜摸| 麻豆国产av国片精品| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美精品啪啪一区二区三区| 涩涩av久久男人的天堂| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美性长视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产一区二区三区综合在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 国产激情久久老熟女| 又黄又粗又硬又大视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 在线观看日韩欧美| 国产人伦9x9x在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久久久久久国产电影| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美乱妇无乱码| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产亚洲av高清不卡| av视频免费观看在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| av网站在线播放免费| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 99国产精品99久久久久| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲免费av在线视频| 精品国产国语对白av| av线在线观看网站| 91成年电影在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲色图综合在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 亚洲av熟女| 久久久久国产一级毛片高清牌| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲精品在线观看二区| 老司机影院毛片| 亚洲成a人片在线一区二区| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久久国产精品麻豆| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲专区中文字幕在线| 久久香蕉国产精品| 午夜老司机福利片| 国产1区2区3区精品| 久久久久久人人人人人| 黄色视频不卡| 欧美日韩福利视频一区二区| 在线观看免费高清a一片| 亚洲专区中文字幕在线| 90打野战视频偷拍视频| 精品久久久久久电影网| 咕卡用的链子| 乱人伦中国视频| 国产av精品麻豆| 欧美丝袜亚洲另类 | 他把我摸到了高潮在线观看| 免费看十八禁软件| 最新美女视频免费是黄的| 一区二区三区激情视频| 黄片小视频在线播放| 成人黄色视频免费在线看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日韩免费av在线播放| 国产男女超爽视频在线观看| 操美女的视频在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 又紧又爽又黄一区二区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲精品自拍成人| 91大片在线观看| 日本黄色视频三级网站网址 | xxxhd国产人妻xxx| 午夜精品国产一区二区电影| 午夜福利在线免费观看网站| 在线av久久热| a级毛片黄视频| 精品国产美女av久久久久小说| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产免费男女视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲国产欧美一区二区综合| 丰满迷人的少妇在线观看| 飞空精品影院首页| 午夜福利免费观看在线| 久久久国产成人精品二区 | 免费在线观看影片大全网站| 色94色欧美一区二区| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美日韩av久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产av又大| 亚洲中文日韩欧美视频| 午夜福利视频在线观看免费| 久久精品国产亚洲av高清一级| 夫妻午夜视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产男女内射视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲第一青青草原| 制服诱惑二区| 91九色精品人成在线观看| 天天影视国产精品| 中亚洲国语对白在线视频| xxx96com| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 激情在线观看视频在线高清 | 黄片播放在线免费| 午夜精品国产一区二区电影| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美成人免费av一区二区三区 | 日韩三级视频一区二区三区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲一区中文字幕在线| 久久精品国产清高在天天线| av福利片在线| 精品国产国语对白av| avwww免费| 青草久久国产| 久久久久久久久免费视频了| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产人伦9x9x在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久中文字幕一级| 成人三级做爰电影| 一区二区三区激情视频| 久久久国产精品麻豆| 精品午夜福利视频在线观看一区| 成年版毛片免费区| 欧美黑人欧美精品刺激| 老司机午夜十八禁免费视频| 手机成人av网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费不卡黄色视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 十八禁网站免费在线| 亚洲免费av在线视频| 九色亚洲精品在线播放| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久久国产成人精品二区 | 韩国精品一区二区三区| 欧美在线一区亚洲| 精品国内亚洲2022精品成人 | 久久精品成人免费网站| 国精品久久久久久国模美| 村上凉子中文字幕在线| a级毛片在线看网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| av中文乱码字幕在线| 亚洲五月天丁香| 看免费av毛片| 天天影视国产精品| 欧美乱妇无乱码| 成人永久免费在线观看视频| 国产欧美日韩一区二区三| 国产国语露脸激情在线看| 精品福利观看| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美成人免费av一区二区三区 | 亚洲av电影在线进入| 高清在线国产一区| 亚洲伊人色综图| 18在线观看网站| netflix在线观看网站| 精品国产美女av久久久久小说| 人人妻人人澡人人看| 亚洲色图av天堂| 一个人免费在线观看的高清视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 午夜视频精品福利| 中文字幕人妻丝袜制服| 黄色丝袜av网址大全| 日韩欧美国产一区二区入口| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久国产亚洲av麻豆专区| avwww免费| 国产成人av教育| 水蜜桃什么品种好| 露出奶头的视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 好男人电影高清在线观看| 一级片免费观看大全| 一级毛片高清免费大全| 在线观看免费视频网站a站| 视频区图区小说| 一二三四在线观看免费中文在| 午夜福利在线免费观看网站| 91大片在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 男人的好看免费观看在线视频 | 黄色a级毛片大全视频| 久久久国产欧美日韩av| 制服诱惑二区| 成年人午夜在线观看视频| 五月开心婷婷网| 久久ye,这里只有精品| 亚洲美女黄片视频| 午夜精品在线福利| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产精品免费大片| 亚洲 国产 在线| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产在视频线精品| 一二三四社区在线视频社区8| 大片电影免费在线观看免费| 日韩免费av在线播放| 国产精品久久视频播放| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 免费少妇av软件| 国产伦人伦偷精品视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久国产乱子伦精品免费另类| 黄片大片在线免费观看| 真人做人爱边吃奶动态| 国产高清视频在线播放一区| 久久人妻熟女aⅴ| 多毛熟女@视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产av精品麻豆| 黄色怎么调成土黄色| 久久亚洲精品不卡| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 操出白浆在线播放| 麻豆成人av在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 香蕉国产在线看| 欧美日韩精品网址| 俄罗斯特黄特色一大片| 一级毛片女人18水好多| 两个人免费观看高清视频| 操出白浆在线播放| 欧美乱色亚洲激情| 岛国毛片在线播放| 成人影院久久| 亚洲第一av免费看| 日本欧美视频一区| 久久九九热精品免费| 手机成人av网站| 亚洲九九香蕉| 国产成人啪精品午夜网站| 午夜影院日韩av| 日韩有码中文字幕| 亚洲三区欧美一区| 亚洲av日韩在线播放| 99国产精品99久久久久| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 高清av免费在线| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 青草久久国产| 一级黄色大片毛片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产成人精品久久二区二区免费| 十八禁网站免费在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 搡老岳熟女国产| 日本vs欧美在线观看视频| 国产高清视频在线播放一区| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲中文日韩欧美视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 黄色片一级片一级黄色片| 不卡一级毛片| 国产黄色免费在线视频| 国产精品国产高清国产av | 国产免费男女视频| 男女午夜视频在线观看| 女警被强在线播放| 身体一侧抽搐| 嫁个100分男人电影在线观看| 手机成人av网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 在线观看舔阴道视频| 啦啦啦 在线观看视频| 9色porny在线观看| 一进一出好大好爽视频| 夫妻午夜视频| 国产不卡一卡二| 777米奇影视久久| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲精品成人av观看孕妇| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 精品一区二区三卡| 久99久视频精品免费| 热re99久久精品国产66热6| 18在线观看网站| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 一本综合久久免费| 国产免费现黄频在线看| 国产99久久九九免费精品| 亚洲男人天堂网一区| 久久影院123| 午夜免费观看网址| 色尼玛亚洲综合影院| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美一级毛片孕妇| 国产成人系列免费观看| 免费不卡黄色视频| 国产深夜福利视频在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久久视频综合| 久久久国产欧美日韩av| 最新在线观看一区二区三区| 乱人伦中国视频| 精品无人区乱码1区二区| 精品电影一区二区在线| 一级作爱视频免费观看| 悠悠久久av| 国产欧美日韩一区二区精品| 老汉色∧v一级毛片| 成年人黄色毛片网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 麻豆乱淫一区二区| 99riav亚洲国产免费| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 在线观看午夜福利视频| 国产乱人伦免费视频| 久久亚洲真实| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 大型av网站在线播放| 老司机亚洲免费影院| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 91麻豆av在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 天天添夜夜摸| 9色porny在线观看| 丁香欧美五月| 久久香蕉激情| 欧美精品亚洲一区二区| 色94色欧美一区二区| 久久久久精品国产欧美久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 高清毛片免费观看视频网站 | 亚洲人成电影观看| av电影中文网址| 久久久久精品人妻al黑| 国产激情久久老熟女| 老熟女久久久| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲九九香蕉| 色婷婷久久久亚洲欧美| 精品福利永久在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 桃红色精品国产亚洲av| 成人av一区二区三区在线看| 热99re8久久精品国产| 午夜影院日韩av| 精品午夜福利视频在线观看一区| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美精品av麻豆av| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美最黄视频在线播放免费 | 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲精品久久午夜乱码| videosex国产| 无限看片的www在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久性视频一级片| 欧美日韩亚洲高清精品| 老司机午夜十八禁免费视频| 搡老岳熟女国产| 男女高潮啪啪啪动态图| 99精品欧美一区二区三区四区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 香蕉久久夜色| 亚洲黑人精品在线| 动漫黄色视频在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| xxx96com| 亚洲性夜色夜夜综合| 在线观看舔阴道视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 成人手机av| 亚洲 国产 在线| 狂野欧美激情性xxxx| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产一区二区激情短视频| 无限看片的www在线观看| 亚洲五月天丁香| 欧美亚洲日本最大视频资源| 免费在线观看亚洲国产| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 黄色视频不卡| 中文字幕精品免费在线观看视频| 1024视频免费在线观看| 老司机靠b影院| 国产成人免费观看mmmm| 欧美黑人精品巨大| 精品国产乱子伦一区二区三区| 老司机影院毛片| 9热在线视频观看99| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| av天堂在线播放| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产成人免费无遮挡视频| 日本a在线网址| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产不卡一卡二| 我的亚洲天堂| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美精品亚洲一区二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品亚洲成国产av| 国产高清videossex| 亚洲中文av在线| 热99国产精品久久久久久7| a在线观看视频网站| www.自偷自拍.com| 校园春色视频在线观看| 十八禁网站免费在线| 成人永久免费在线观看视频| 久久久久国内视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 精品久久蜜臀av无| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美乱码精品一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久久久久久国产电影| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 19禁男女啪啪无遮挡网站| av不卡在线播放| 这个男人来自地球电影免费观看| 好男人电影高清在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产在视频线精品| 男人的好看免费观看在线视频 | 久久久久久人人人人人| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91|