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    重組表達(dá)小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

    2012-02-01 09:28:00余英豪
    關(guān)鍵詞:滴度載體引物

    劉 偉,余英豪

    (中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院病理科,福州 350025)

    人體的抗腫瘤免疫反應(yīng)主要是由激活的T淋巴細(xì)胞介導(dǎo),T細(xì)胞激活需要雙信號(hào)系統(tǒng),第一信號(hào)是由T細(xì)胞受體(TCR)與抗原肽-MHC復(fù)合物相結(jié)合所提供,第二信號(hào)是由輔助分子或共刺激分子通過(guò)與T細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合而傳遞的,其中以B7分子的共刺激作用最為重要,而腫瘤細(xì)胞表面往往缺乏或低表達(dá)B7分子,是腫瘤細(xì)胞逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視和滅殺的重要機(jī)制之一[1]。因此,通過(guò)轉(zhuǎn)基因使腫瘤細(xì)胞表達(dá) B7分子,為 T淋巴細(xì)胞激活提供第二信號(hào),從而激活T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。MIP-1α類屬 CC趨化因子,與其相應(yīng)受體結(jié)合后誘導(dǎo)趨化T細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞,募集到腫瘤局部,產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)[2,3]。

    從理論上推測(cè),趨化因子 MIP-1α和共刺激分子B7-1基因轉(zhuǎn)染淋巴瘤細(xì)胞后,機(jī)體抗淋巴瘤免疫作用可能會(huì)明顯增強(qiáng)。為此,本研究擬建立重組表達(dá)小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒載體,為淋巴瘤基因治療的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 慢病毒載體:慢病毒載體pGC-FU Vector購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

    1.1.2 菌株來(lái)源:大腸桿菌 DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.1.3 細(xì)胞株:293T細(xì)胞,由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.1.4 主要試劑:1 kp DNA ladder Marker,250 bp DNA ladder Marker(Fermentas公司);AgeI,(NEB公司);In-Fusion kit(BD 公 司);Taq polymerase (SinoBio公司);Plasm id抽提Kit(Promega公司);一抗 Mouse Anti-GFP,二抗 Goat Anti-Mouse(Santa-Cruz公司);Lipofectamine2000(Invitrogen公司);MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(PROMEGA公司)。

    1.1.5 主要儀器和器材:PCR 儀(Applied Biosystems公司);穩(wěn)壓DNA電泳儀(BioRad公司); SDS-PAGE蛋白電泳儀,蛋白轉(zhuǎn)膜儀(上海天能公司);5417R臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(Eppendorf公司);陽(yáng)性克隆測(cè)序在上海美季生物技術(shù)公司完成。

    1.2 方法

    1.2.1 MIP-1α和 B7-1基因重組慢病毒載體的構(gòu)建:

    (1)慢病毒載體酶切 使用 AgeI進(jìn)行酶切消化,50μL反應(yīng)體系,含 ddH2O 42μL,10×buffer 5μL,純化的 DNA質(zhì)粒(1 ug/μL)2μL,AgeI (5 U/μL)1μL,將上述混合的反應(yīng)物置37℃ 2 h。

    (2)目的基因片段獲取 從 GeneBank中查尋小鼠MIP-1α和B7-1基因序列,設(shè)計(jì)引物,引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

    ①引物合成 設(shè)計(jì)B7-1和 MIP-1α基因引物(表1)

    ②PCR擴(kuò)增目的基因 分別以 Primer(+): MIP-1α-AgeI-F,Primer(-):MIP-1α-AgeI-R 和Primer(+):B7-1-AgeI-F,Primer(-):B7-1-AgeI-R為引物,進(jìn)行目的基因 MIP-1α和 B7-1的 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL,目的基因M IP-1α的PCR反應(yīng)循環(huán)條件:94℃ 5 min→(94℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s)30循環(huán)→72℃ 10 m in→4℃ +∞;目的基因B7-1的PCR反應(yīng)循環(huán)條件:94℃ 5 min→(94℃30 s→55℃ 30 s→72℃ 1 m in)30循環(huán)→72℃ 10 min→4℃+∞。

    (3)重組克隆制備

    ①感受態(tài)制備 用氯化鈣制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,并分裝置-70℃凍存。

    ②PCR產(chǎn)物交換進(jìn)入線性化慢病毒載體(表2)。

    表1 B7-1和MIP-1α基因引物Tab.1 The primers of B7-1 and MIP-1 gene

    表2 PCR產(chǎn)物反應(yīng)體系Tab.2 PCR reaction system

    于25℃ 反應(yīng)30 min,再于42℃ 反應(yīng)15 min,制備克隆交換液,準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。陽(yáng)性對(duì)照和自連對(duì)照,加入的載體和連接組一致,但陽(yáng)性對(duì)照加入的純化PCR產(chǎn)物為GAPDH基因(同樣帶有交換臂)。

    ③轉(zhuǎn)化按說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到Amp抗性(100 ug/m L)的LB瓊脂培養(yǎng)基上,長(zhǎng)出的克隆進(jìn)行后續(xù)PCR鑒定。

    (4)陽(yáng)性克隆的PCR鑒定 在長(zhǎng)出的克隆菌表面沾一下,溶于10μL LB,混勻后取1μL作為菌落PCR模板;分別以 PCR引物:Primer(+):Ubi-F; Primer(-):EGFP-N-R進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20μL。目的基因MIP-1α的PCR條件:94℃2 min→94℃ 30 s→60℃ 30 s→72℃ 30 s)30循環(huán)→72℃ 6 min→4℃ +∞。目的基因 B7-1的 PCR條件:94℃ 2 min→(94℃ 30 s→60℃ 30 s→72℃ 1 m in)30循環(huán)→72℃ 6 min→4℃ +∞。設(shè)陰性對(duì)照,自連對(duì)照,陽(yáng)性對(duì)照。

    1.2.2 Western blot檢測(cè)目的基因質(zhì)粒表達(dá):

    重組 MIP-1α和 B7-1目的基因質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,24 h后觀察熒光表達(dá)情況,收集轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液裂解抽提蛋白,按照Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作說(shuō)明分別進(jìn)行檢測(cè),十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加入一抗Mouse Anti-GFP,二抗Goat Anti-Mouse,進(jìn)行雜交、洗膜等操作后,曝光、顯影定影。

    1.2.3 重組慢病毒載體的包裝及滴度測(cè)定:

    (1)慢病毒的包裝 重組慢病毒pGC-LV載體,pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體組成的三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,按照 Lipofectam ine 2000的說(shuō)明書操作。收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細(xì)胞上清液,離心濃縮后分裝在病毒管中,-80℃長(zhǎng)期保存。取其中一支行病毒滴度測(cè)定。

    (2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定慢病毒滴度

    ①樣品制備 檢測(cè)前1天,對(duì)293T細(xì)胞傳代,每個(gè)24孔中加1×105個(gè)細(xì)胞。次日,準(zhǔn)備7~10個(gè)無(wú)菌的 Ep管,在每個(gè)管中加入 90μL培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)。取待測(cè)病毒原液10μL加入到第一管中,混勻后,取10μL加入到第二管中。繼續(xù)相同的操作直到最后一管。第1個(gè)Ep管中加入10 uL病毒原液,記為1E+1μL;第二個(gè) Ep管中進(jìn)行了第1次10倍稀釋,所得病毒原液為第1個(gè) Ep中的1/10,記為1E+0μL;依次類推…,第7個(gè)Ep管中進(jìn)行了第6次10倍稀釋,所得病毒原液為第6個(gè)Ep中的1/10,記為1E-5μL。

    ②總 RNA 抽提 根據(jù) Invitrogen公司的TRIZOL操作說(shuō)明書進(jìn)行,均為RNase-free操作。紫外分析測(cè)定所抽提RNA的濃度。

    ③RNA逆轉(zhuǎn)錄獲cDNA 目的基因GFP:上游引物:5'-TGCTTCAGCCGCTACCC-3',下游引物:5'-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3';ACTIN基因:上游引物:5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3',下游引物: 5'-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3'。

    按Promega公司的M-MLV操作說(shuō)明書進(jìn)行,均為RNase-free操作。RT反應(yīng)體系11μL,得到的RT反應(yīng)產(chǎn)物cDNA立即用于PCR,部分保存在-80℃冰箱中。

    ④實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) Real-time PCR在Bio-rad的iQ5上完成??偡磻?yīng)體系20μL,設(shè)定程序?yàn)閮刹椒≧eal-Time定量:預(yù)變性95℃ 15 s,之后每一步變性95℃ 5 s,退火延伸60℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。制作熔解曲線:PCR結(jié)束后,再95℃變性1 m in,冷卻至55℃,使DNA雙鏈充分結(jié)合。從55℃開始到95℃,每一步增加 0.5℃,保持 30 s,同時(shí)讀取吸光值。

    2 結(jié)果

    2.1 慢病毒載體pGC-FUVector酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖譜(圖1)。

    圖1 慢病毒載體pGC-FU Vector酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 The agarose gel electrophoresis result of Lentiviral vector pGC-FU

    2.2 目的基因 MIP-1α和B7-1PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜(圖2)。

    2.3 陽(yáng)性克隆的PCR鑒定

    (1)MIP-1α陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子得到483 bp的條帶,陰性轉(zhuǎn)化子得到198 bp的條帶,初步表明 MIP-1α基因重組慢病毒載體構(gòu)建成功(圖3)。

    (2)B7-1陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子得到1125 bp的條帶,陰性轉(zhuǎn)化子得到198 bp的條帶,初步表明 B7-1基因重組慢病毒載體構(gòu)建成功(圖4)。

    2.4 陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果及結(jié)果分析

    接種陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,37℃ 培養(yǎng)16 h保存為甘油菌,分別分裝200μL送上海美季生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向序列測(cè)序,比對(duì)分析證實(shí),MIP-1α和B7-1基因測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致。

    2.5 重組 MIP-1α和 B7-1目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48h后的熒光蛋白表達(dá)情況(彩插4圖5~6)。

    2.6 WesternBlot檢測(cè)結(jié)果

    Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示 MIP-1α基因融合GFP和B7-1基因融合 GFP在293T細(xì)胞中都獲得表達(dá)(彩插4圖7~8)。

    圖2 目的基因MIP-1α和B7-1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 The agarose gel electrophoresis results of targetsegments of M IP-1αand B7-1 gene

    圖3 MIP-1α轉(zhuǎn)化子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖Fig.3 The electrophoresis results of target segment of M IP-1αgene

    2.7 重組MIP-1α慢病毒滴度測(cè)定

    (1)實(shí)時(shí)定量PCR曲線圖(圖9)

    (2)不同濃度病毒感染后樣品組的 Ct值及表達(dá)量分析(表3)

    加入不同病毒量的細(xì)胞樣品,通過(guò)比較control

    圖4 B7-1轉(zhuǎn)化子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖Fig.4 The electrophoresis results of target segment of B7-1 gene

    圖9 加入不同重組M IP-1α慢病毒量的細(xì)胞樣品隨著PCR循環(huán)的增加,熒光值開始上升,經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)后均達(dá)到峰值Fig.9 Fluorescence curve in different M IP-1αgene groups gradually rose with the PCR process and reached the peak after 40 cycles

    表3 病毒感染后樣品組的Ct值及表達(dá)量Tab.3 The Ct values of different groups infected with virus

    組和試驗(yàn)組的Ct值差異判斷滴度值。判斷標(biāo)準(zhǔn)為Ct值差異 >2即存在顯著差異。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所獲得的20μLcDNA中只取了1μL用于實(shí)時(shí)定量檢測(cè),該結(jié)果僅表示1/20樣品的情況,所以在滴度計(jì)算時(shí)應(yīng)該乘以系數(shù)20。

    在本次滴度檢測(cè)中,1E-4μL組樣品和 control組樣品的差值,即△CtCon-△Ct樣品組=2.075>2,說(shuō)明1E-4μL組與control組樣品的Ct值存在顯著差異,證實(shí)1E-4μL組樣品中存在病毒顆粒。假定該組樣品含有至少1個(gè)病毒顆粒,則病毒的滴度為:1/ (1E-4)*20=2.00E+5 TU/μL=2.00E+8 TU/m L。

    (3)目的基因及 Actin基因的熔解曲線(圖10)。

    2.8 重組B7-1慢病毒滴度測(cè)定

    (1)實(shí)時(shí)定量PCR曲線圖(圖11)。

    圖10 Actin基因和目的基因的熔解曲線Fig.10 The melting curve of actin gene and target gene

    圖11 加入不同重組B7-1慢病毒量的細(xì)胞樣品隨著PCR循環(huán)的增加,熒光值開始上升,經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)后均達(dá)到峰值Fig.11 Fluorescence curve in different B7-1 gene groups gradually rose with the PCR process and reached the peak after 40 cycles

    (2)不同濃度病毒感染后樣品組的 Ct值及表達(dá)量分析(表4)

    在本次滴度檢測(cè)中,1E-4μL組樣品和1E-5 μL組樣品的 Ct值,即△Ct1E-4μl組-△Ct1E-5μl組= 22.27-19.695=2.575>2,說(shuō)明 1E-04μL組與1E-5μL組樣品的 Ct值存在顯著差異,病毒滴度為:1/(1E-4)*20=2.00E+5 TU/μL=2.00E+8 TU/m L。

    (3)目的基因及Actin基因的熔解曲線

    ①Actin基因的熔解曲線(圖12)。

    表4 病毒感染后樣品組的Ct值及表達(dá)量Tab.4 The Ct values of different groups infected with virus

    3 討論

    腫瘤基因治療的關(guān)鍵是載體的選擇,用于基因治療的載體系統(tǒng)可分為病毒性載體和非病毒性載體兩類。目前常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體等,但是這些載體均存在不足之處,嚴(yán)重影響了基因治療的有效性及安全性。慢病毒載體是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體,它對(duì)分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞均具有感染能力,能夠整合到宿主細(xì)胞的基因組中,可以在體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá),還具有容納外源性目的基因片段大、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)[4]。本研究所用的 Lentivirus為“自殺”性病毒,即病毒感染目的細(xì)胞后不會(huì)再感染其他細(xì)胞,也不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代,屬于假型病毒,但該病毒仍然具有潛在的生物學(xué)危險(xiǎn)[5,6]。目前,慢病毒載體已被應(yīng)用于帕金森氏病、鐮狀細(xì)胞貧血、血友病、肝癌及結(jié)直腸癌等疾病的研究[7-11]。

    圖12 Actin基因和目的基因的熔解曲線Fig.12 The melting curve of actin gene and target gene

    本研究中,我們自行設(shè)計(jì)引物合成和PCR擴(kuò)增目的基因后,將目的基因與酶切線性化的慢病毒載體進(jìn)行定向連接,其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞,對(duì)長(zhǎng)出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定及直接測(cè)序比對(duì)分析,證實(shí)測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)基因序列完全一致,表明B7-1和 MIP-1α基因重組慢病毒載體構(gòu)建成功。B7-1目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48 h后,在熒光顯微鏡下能夠觀察到>90%的293T細(xì)胞中有強(qiáng)熒光表達(dá);然而為何MIP-1α目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,只觀察到部分細(xì)胞中有熒光表達(dá)呢?這是因?yàn)樾∈驧IP-1α蛋白是分泌蛋白[12],表達(dá)后分泌到胞外,在細(xì)胞內(nèi)不能逐漸蓄積所含 M IP-1α蛋白量較少,故僅觀察到部分細(xì)胞有熒光蛋白表達(dá)。Western Blot檢測(cè)到目的基因 B7-1和 MIP-1α融合GFP的表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)了目的基因重組載體在293T細(xì)胞中的表達(dá)。

    目前常用的測(cè)定慢病毒滴度的方法有孔稀釋法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR,孔稀釋法是根據(jù)目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的熒光表達(dá)情況計(jì)算病毒的滴度,由于熒光蛋白的表達(dá)程度易受到插入的目的基因片段的影響,從而導(dǎo)致該方法不能準(zhǔn)確反映病毒的滴度,從而其應(yīng)用受到限制。另外,如果目的基因表達(dá)的蛋白為分泌蛋白,因轉(zhuǎn)錄翻譯生成的蛋白不能在細(xì)胞的胞漿或包膜中蓄積,導(dǎo)致觀察不到或僅觀察到較弱的熒光表達(dá),應(yīng)用孔稀釋法就難以準(zhǔn)確測(cè)定病毒滴度。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)病毒基因組RNA的拷貝數(shù),不受目的基因轉(zhuǎn)錄翻譯生成的蛋白類型和蛋白表達(dá)量的影響,既能檢測(cè)蛋白表達(dá)定位于胞漿及胞膜的目的基因,也能檢測(cè)到表達(dá)分泌蛋白的目的基因,此方法簡(jiǎn)便易行、靈敏度高、特異性好;本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)到B7-1和MIP-1α基因重組慢病毒載體的滴度均達(dá)到2.00E+8 TU/m L;雖然其能夠比較準(zhǔn)確的反映慢病毒載體的整合情況,但不能準(zhǔn)確反應(yīng)目的蛋白的實(shí)際表達(dá)情況[13,14],其原因可能是由于病毒載體整合入靶細(xì)胞異染色質(zhì)中,使目的蛋白表達(dá)受到影響。

    在應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)重組慢病毒載體滴度的過(guò)程中,由熔解曲線來(lái)分析產(chǎn)物的均一性有助于更準(zhǔn)確地分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量結(jié)果。由于SYBR GreenⅠ與所有的雙鏈DNA相結(jié)合,因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性。通過(guò)測(cè)量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。熒光強(qiáng)度變化的拐點(diǎn)(熔點(diǎn),Tm)為熔解峰值。本研究的熔解曲線圖中沒(méi)有出現(xiàn)雜峰,也未出現(xiàn)主峰的異常增寬,表明實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增,B7-1和MIP-1α基因重組慢病毒載體的滴度均達(dá)2.00E+8 TU/m L。

    B7-1和MIP-1α基因重組慢病毒載體的成功構(gòu)建,為后續(xù)淋巴瘤基因治療奠定了基礎(chǔ)。

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