短端粒小鼠與正常小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)比較

宋 舸，張俊伶，鞠振宇

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所天津市分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192）

實(shí)驗(yàn)小鼠作為研究間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）功能的載體發(fā)揮著重要作用，傳統(tǒng)獲取小鼠MSC方法主要來(lái)自骨髓，利用MSC細(xì)胞具有在塑料培養(yǎng)皿上貼壁的特點(diǎn)得到。但是因?yàn)樾∈蠊撬璧腗SC數(shù)量很少，并且有造血細(xì)胞的污染，常給研究帶來(lái)不少不確定因素。此后不斷對(duì)此方法進(jìn)行改進(jìn)，如通過(guò)磁珠分選、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等，然而仍舊存在不易標(biāo)準(zhǔn)化，并且有或多或少損傷細(xì)胞生物學(xué)特性的問(wèn)題。因此，受到有關(guān)人體骨片中獲得MSC的方法的啟發(fā)［1］，我們嘗試通過(guò)培養(yǎng)小鼠的下肢皮質(zhì)微粒骨，同時(shí)也由于皮質(zhì)骨中造血細(xì)胞污染機(jī)會(huì)很少，希望建立獲得小鼠MSC簡(jiǎn)便穩(wěn)定的方法。

端粒是真核細(xì)胞染色體末端的一種保護(hù)性結(jié)構(gòu)，在維持染色體末端穩(wěn)定性等方面起重要作用。端粒被認(rèn)為是細(xì)胞衰老的生物鐘。研究證明端粒的長(zhǎng)度隨著人體的衰老呈進(jìn)行性縮短，端粒的長(zhǎng)度與許多衰老相關(guān)的疾病密切相關(guān)。骨質(zhì)疏松作為一種與衰老相關(guān)的疾病，也與染色體末端端粒功能的異常相關(guān)［2］。研究衰老模型的 Terc-/-鼠，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代到第三代（G3），其端粒長(zhǎng)度與人接近，而且它的骨骼畸形、骨質(zhì)疏松的表型也更加容易觀察，因此本實(shí)驗(yàn)以WT鼠和Terc-/-鼠G3為研究對(duì)象，通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)建立獲取MSC的方法，初步比較它們的生物學(xué)特征，為今后深入研究其各項(xiàng)功能提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

WT鼠和Terc-/-鼠的飼養(yǎng)和使用符合中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所標(biāo)準(zhǔn)。研究使用的小鼠均為G3代，WT為對(duì)照。分別取2月齡和9月齡鼠各5只，所用的動(dòng)物遺傳背景為 C57BL/6。WT鼠購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（軍）2007-004］。

1.2 小鼠皮質(zhì)骨MSC的分離

小鼠脫頸處死后，浸泡在70％酒精中2 m in，轉(zhuǎn)入100 mm無(wú)菌平皿，切開(kāi)下肢皮膚，顯微剪刀盡可能分離干凈附著在股骨和脛骨上的肌肉、韌帶，將骨組織放入無(wú)菌紗網(wǎng)布上，搓去殘留的肌肉和韌帶。將骨組織置入35 mm無(wú)菌平皿中，加入5 m l培養(yǎng)液（α-MEM+1％P/S+2％FBS），為保持MSC細(xì)胞活性，操作不易超過(guò)2 h。剪去骨兩端的骨骺以便沖洗髓腔內(nèi)的造血細(xì)胞，沖洗至髓腔變白。將骨組織剪成1～3 mm2大小顆粒，轉(zhuǎn)至25 cm2平皿中，加入3 mLα-MEM（含1 mg/mL膠原酶Ⅱ），在37℃振搖1～2 h。回收消化松散的骨片準(zhǔn)備原代培養(yǎng)。

1.3 小鼠皮質(zhì)骨MSC的原代培養(yǎng)

將經(jīng)上述分離所得的骨片種于25 cm2平皿中，加入6 m Lα-MEM（含10％FBS及1％P/S），在37℃，5％CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)3 d，此間避免不必要的晃動(dòng)干擾。3 d后更換培養(yǎng)液，棄未黏附的細(xì)胞，加入6 m Lα-MEM（含10％FBS及1％P/S）繼續(xù)培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)5 d后，棄培養(yǎng)液，加入3 m L 0.25％胰酶+0.02％EDTA（室溫）消化3 m in，回收細(xì)胞。骨片仍用于繼續(xù)獲得MSC細(xì)胞，方法同前。MSC細(xì)胞按每孔細(xì)胞1×104個(gè)CM2的密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，加入α-MEM（含10％FBS及1％P/S）培養(yǎng)液，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)；接種3 d后進(jìn)行第1次換液，以后隔日換液。每天隨機(jī)抽取3只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的MSC作細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)觀察，直至貼壁細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔的底部。

1.4 小鼠皮質(zhì)骨MSC的傳代培養(yǎng)及 MSC的增殖分析

原代培養(yǎng)一旦鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔的表面，即可用0.25％胰酶+0.02％EDTA液消化分離（18～25℃，3 min）貼壁細(xì)胞，傳代接種培養(yǎng)的比例1∶3，標(biāo)記為P1，隔日換液，至貼壁細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔的底面。再重復(fù)以上操作，進(jìn)行下一代傳代接種培養(yǎng)，標(biāo)記為P2，余類推。抽取3只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物MSC由P1代開(kāi)始，逐代進(jìn)行傳代培養(yǎng)，直至培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)衰老征象，停止傳代培養(yǎng)。以細(xì)胞群體倍增值（population doublings，PDs）［3］作為分析動(dòng)物 MSC的自我更新能力的指標(biāo)，PDs=lg（培養(yǎng)后細(xì)胞計(jì)數(shù)/培養(yǎng)前細(xì)胞計(jì)數(shù)）/lg2。各代PDs值累加即得最終的累積細(xì)胞群體 倍 增 值 （cumulative population doublings，CPDs）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS16.0軟件，將2月齡和9月齡WT鼠和Terc-/-鼠MSC的傳代生長(zhǎng)克隆數(shù)取均數(shù)，進(jìn)行計(jì)量資料的T檢驗(yàn)比較。

2 結(jié)果

2.1 MSC原代培養(yǎng)的生長(zhǎng)特征

WT鼠MSC原代培養(yǎng)生長(zhǎng)顯示，原代接種后的48 h開(kāi)始從骨片遷出并貼壁，其后24 h可見(jiàn)大量細(xì)胞游出在骨片邊緣，貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞外形為紡錘型或梭形，3 d為MSC生長(zhǎng)的潛伏期，此期主要為MSC的貼壁生長(zhǎng)階段，培養(yǎng)細(xì)胞的有絲分裂活動(dòng)不甚活躍；第4～6天開(kāi)始，相差顯微鏡下可以觀察到貼壁細(xì)胞已形成大小不一的多個(gè)細(xì)胞克隆，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞的有絲分裂活動(dòng)開(kāi)始變得活躍起來(lái)（圖1）；第7～8天這些細(xì)胞克隆進(jìn)一步擴(kuò)大，許多細(xì)胞克隆彼此相連，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示此階段細(xì)胞數(shù)目呈指數(shù)級(jí)遞增，此期為MSC原代培養(yǎng)生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)增殖期；第9～11天，細(xì)胞克隆彼此相連并鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔底面的大部分，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示MSC生長(zhǎng)進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期；隨后貼壁生長(zhǎng)的MSC開(kāi)始鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔底面，原代培養(yǎng)結(jié)束。通過(guò)比較2月齡和9月齡WT鼠和Terc-/-鼠 MSC的原代生長(zhǎng)特征，Terc-/-鼠的MSC生長(zhǎng)緩慢，形成克隆數(shù)量少，原代細(xì)胞形成克隆數(shù)為WT鼠＞Terc-/-鼠。

圖1 接種4 d后MSC形態(tài)鏡下觀察Fig.1 Morphology of MHCs observed by microscope

2.2 MSC傳代培養(yǎng)的生長(zhǎng)特征

WT鼠MSC傳代培養(yǎng)多數(shù)于P9代以后開(kāi)始出現(xiàn)衰老征象。傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)較原代要快些，多于接種后10 d即可鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔的底面。對(duì)2月齡和9月齡WT鼠和Terc-/-鼠傳代細(xì)胞培養(yǎng)觀察比較，以鏡下大于10個(gè)細(xì)胞的計(jì)為一個(gè)集落（圖2，P＜0.01）。傳代培養(yǎng)潛伏期約為24～36 h；傳代培養(yǎng)對(duì)數(shù)增殖期約為4～6 d；對(duì)數(shù)增殖期結(jié)束后至接種后第10天，MSC生長(zhǎng)逐漸緩慢，進(jìn)入平臺(tái)期。

2.3 MSC自我更新能力分析

隨著傳代培養(yǎng)代數(shù)的漸次增加，MSC的生長(zhǎng)速度有逐漸緩慢的趨勢(shì)。傳代接種第5天后，Terc-/-鼠P4以后的MSC生長(zhǎng)速度減緩明顯，至接種后第10天計(jì)算所得的MSC數(shù)目WT鼠＞Terc-/-鼠。三種不同基因型鼠各隨機(jī)抽取的3個(gè)樣本，傳代培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)衰老征象的情況分別是：WT鼠于P10，Terc-/-鼠于 P7，故統(tǒng)計(jì) MSC的 PDs及 CPDs計(jì)算至P7。由圖3可見(jiàn)，從P1至P8每代MSC的

圖2 小鼠MSC的P2傳代細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)情況Fig.2 Culture status on passage 2 cells of MSC from mice

PDs值在P3達(dá)到高峰，而P7之后則僅為不足1，說(shuō)明增殖能力減弱；WT鼠的CPDs值為10.4±1.1，明顯高于Terc-/-鼠，在P1至P7階段的體外培養(yǎng)分離中，MSC的有絲分裂活動(dòng)旺盛，具有活躍的增殖倍增能力。

圖3 兩種小鼠MSC傳代培養(yǎng)的CPDL變化比較Fig.3 Cumulative population doublings＇difference between two type mice

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞多來(lái)自骨髓，也存在于其它器官和組織［4］，一定條件下MSC可以分化成多種組織，包括骨，脂肪和軟骨。MSC的功能除了促進(jìn)造血和組織修復(fù)外，更多的應(yīng)用在疾病治療方面，如骨骼缺損，糖尿病，急性移植排斥反應(yīng)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。為實(shí)現(xiàn)上述臨床應(yīng)用研究，以小鼠為研究對(duì)象進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究，如何從小鼠提取足夠多的MSC成為關(guān)鍵。

小鼠 MSC分離培養(yǎng)方法起初由 Friedenstein等［5］建立，利用MSC具有能粘貼在塑料培養(yǎng)瓶的特性分離MSC，利用該方法從人類和大動(dòng)物骨髓中分離獲得MSC比較成功，但在小鼠骨髓內(nèi)獲得足夠多的MSC相對(duì)困難，因?yàn)樾∈蟮墓撬枨粌?nèi)MSC數(shù)量低，同時(shí)也存在造血細(xì)胞的污染。為了改進(jìn)這這一方法，有研究嘗試使用磁珠分選、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染和建立獨(dú)特培養(yǎng)體系等方法［6，7］，但是這些方法標(biāo)準(zhǔn)化困難，并且或多或少損傷細(xì)胞生物活性。

細(xì)胞生物學(xué)原理顯示細(xì)胞的數(shù)量及密度對(duì)其增生和分化會(huì)產(chǎn)生很大的影響，由于小鼠MSC在骨髓中所占的細(xì)胞比例少，因此設(shè)法改進(jìn)在體外條件下提取純化更多MSC成為實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以小鼠皮質(zhì)骨微小骨片獲得鼠MSC的培養(yǎng)方法，獲得了大量的MSC，方法簡(jiǎn)單且重復(fù)性好。相同的獲取MSC的方法見(jiàn)于人體松質(zhì)骨骨片［8］。與從小鼠股骨骨髓腔獲得 MSC不同，本方法通過(guò)多次沖洗髓腔，力求徹底減少造血等細(xì)胞的污染，將皮質(zhì)骨切成微小骨塊酶消化后置于培養(yǎng)液內(nèi)，開(kāi)始3 d內(nèi)不需要換培養(yǎng)液，48 h可見(jiàn)骨片周圍有成纖維樣細(xì)胞，72 h可以觀察到克隆形成，優(yōu)于骨髓腔來(lái)源的MSC培養(yǎng)觀察。這種方法可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量（數(shù)量＞107）MSC細(xì)胞，并且培養(yǎng)過(guò)程中不需要額外添加細(xì)胞生長(zhǎng)因子，渴望為今后實(shí)驗(yàn)研究小鼠MSC提供比較好的技術(shù)支撐。

端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端的帽狀結(jié)構(gòu)，主要功能是穩(wěn)定染色體，保護(hù)DNA。正常細(xì)胞每分裂一次，端粒都會(huì)縮短。端?？s短限制了細(xì)胞的壽命，在衰老和慢性病過(guò)程中細(xì)胞的增殖能力下降，當(dāng)端?？s短到一定程度，染色體末端脫帽導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。因?yàn)閃T鼠的端粒長(zhǎng)度是人類的五倍，所以建立3～6代以后的鼠，這時(shí)的端粒才會(huì)足夠短，表型也容易觀察［9］。通過(guò)建立觀察端粒酶基因敲除鼠 G3（Terc-/-鼠第三代）的表型，發(fā)現(xiàn)Terc-/-鼠存在造血功能、成骨能力以及消化系統(tǒng)的明顯衰老，骨骼器官的衰老主要原因可能來(lái)自MSC的功能異常，經(jīng)過(guò)原代和傳代培養(yǎng)觀察，Terc-/-鼠MSC的增殖能力明顯低于WT鼠。通過(guò)對(duì)MSC連續(xù)傳代培養(yǎng)，結(jié)果顯示，Terc-/-鼠MSC在經(jīng)歷了7代的傳代培養(yǎng)以后MSC出現(xiàn)衰老征象，即細(xì)胞增生速度緩慢，多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核碎裂及由培養(yǎng)孔底面脫落等，這與許多其他種類細(xì)胞的體外傳代培養(yǎng)的結(jié)局相似。因此有關(guān)這種衰老現(xiàn)象出現(xiàn)的機(jī)理有待于通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡明。此外，與原代培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線相比，傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)潛伏期較短，每代鋪滿培養(yǎng)孔底面需要時(shí)間短于原代細(xì)胞，這種共性見(jiàn)于WT鼠和Terc-/-鼠。

組織發(fā)生生物學(xué)認(rèn)為，MSC可以向所有的中胚層起源的組織細(xì)胞方向進(jìn)行分化，這是涉及諸多機(jī)制和階段的復(fù)雜過(guò)程［10］。已有報(bào)道通過(guò)MSC來(lái)修復(fù)骨組織、關(guān)節(jié)軟骨組織的缺損大都建立在大動(dòng)物基礎(chǔ)上，如兔，羊，犬等，這些大動(dòng)物骨髓內(nèi)的 MSC數(shù)量雖然較多，能滿足研究需要，但是面對(duì)日益復(fù)雜的疾病模型研究，大動(dòng)物無(wú)法提供靈活而豐富的基因型，小鼠則具有這一優(yōu)勢(shì)，這無(wú)疑為MSC研究提供更佳選擇?，F(xiàn)在，我們成功建立小鼠的MSC體外分離培養(yǎng)方法，初步觀察對(duì)比 G3WT鼠和G3Terc-/-鼠的MSC生長(zhǎng)和增殖特征，以此為基礎(chǔ)，為我們今后深入研究MSC的各項(xiàng)功能提供啟發(fā)和指導(dǎo)。

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