不同數(shù)目骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠肺損傷的抑制作用

趙科研，王輝山，侯明曉，孫江濱，吳慧穎，柳克祥

（1.中國(guó)人民解放軍沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院心血管外科，沈陽(yáng) 110016； 2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院心血管外科，長(zhǎng)春 130041）

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary artery hypertension，PAH）是頑固性和致死性疾病，肺血管阻力進(jìn)行性增高，最終導(dǎo)致右心衰竭而死亡，是嚴(yán)重的內(nèi)皮功能障礙的血管疾病。人們嘗試再生手段打斷 PAH的惡性循環(huán)，移植骨髓細(xì)胞，如內(nèi)皮祖細(xì)胞、內(nèi)皮樣祖細(xì)胞和基質(zhì)干細(xì)胞，以再生健康的內(nèi)皮細(xì)胞，顯示了初步的療效［1-3］。野百合堿是豆科植物野百合中提取的生物堿，具有細(xì)胞毒性作用，代謝產(chǎn)物通過(guò)肺臟時(shí)沉積于肺小動(dòng)脈壁及肺毛細(xì)血管，導(dǎo)致對(duì)肺血管的損傷，破壞肺組織內(nèi)皮細(xì)胞等，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓，常做為制作肺動(dòng)脈高壓模型的藥物［4］。對(duì)于不同MSCs數(shù)量移植的安全性，以及移植對(duì)MCT誘導(dǎo)肺血管損傷的抑制效應(yīng)如何尚不明確，本文對(duì)此研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性W istar大鼠（3周，60～70 g），成年雄性W istar大鼠60只，體重（180～250）g，均由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK［吉］2008-0005）。

1.2 主要儀器和試劑

全自動(dòng)顯微鏡數(shù)碼攝像系統(tǒng)（OLYMPUS，日本），LEICA病理切片機(jī)（德國(guó)），多功能病理圖象分析儀（同濟(jì)），BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson美國(guó)）。低糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），特級(jí)胎牛血清（Gibco公司），胰酶（Sigma公司），亞美尼亞倉(cāng)鼠抗大鼠CD29-Alexa Fluor（Biolegend公司），小鼠抗大鼠CD45-FITC（Biolegend公司），小鼠抗大鼠CD44-PE（Santa Cruz公司），小鼠抗大鼠CD34 -FITC（Santa Cruz公司），平滑肌 Actin免疫組化試劑盒（武漢博士德）。

1.3 方法

1.3.1 MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

W istar大鼠幼鼠斷頸處死，酒精浸泡15 m in，無(wú)菌條件下分離股骨、脛骨，DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔。洗滌，沉淀以含10％胎牛血清的DMEM混懸，接種在100 m L培養(yǎng)瓶中，5％CO2，37℃下培養(yǎng)。24～48 h后換液，每2～3 d更換一次培養(yǎng)基，相差顯微鏡觀察細(xì)胞融合情況。細(xì)胞80％融合后0.25％胰酶消化，計(jì)數(shù)并傳代。收獲第3代細(xì)胞，CD29-Alexa Fluor、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-FITC鑒定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。3～5代MSCs以0.25％的含EDTA的胰酶收獲，PBS沖洗，以 PBS懸浮細(xì)胞1000個(gè)/μL，置于冰上直到進(jìn)行移植。

1.3.2 不同細(xì)胞數(shù)量靜脈移植對(duì)正常大鼠 RVSP的影響

采用正常健康雄性大鼠20只，依據(jù)移植MSCs個(gè)數(shù)分為5×105組、1×106組、5×106組和對(duì)照（生理鹽水）組，每組5只。大鼠頸部正中切口，游離左側(cè)及右側(cè)頸外靜脈，通過(guò)右側(cè)頸外靜脈插管至右心室檢測(cè)RVSP，通過(guò)左側(cè)頸外靜脈注入不同數(shù)目MSCs，測(cè)量細(xì)胞移植前、移植后5 m in，30 min及 24 h的RVSP。

1.3.3 動(dòng)物分組

成年雄性 W istar大鼠 40只，分為 4組：①M(fèi)CT/MSCs 5×105組；②MCT/MSCs 1×106組；③MCT組；④對(duì)照組。MCT組給予野百合堿60 mg/ kg，腹腔注射，對(duì)照組注入等量鹽水。全麻后固定大鼠，頸部正中切口，游離右側(cè)頸外靜脈，1 m L注射器給予MSCs或等量PBS溶液（MCT組和對(duì)照組），4周后進(jìn)行測(cè)壓、取材。

1.3.4 移植4周后大鼠RVSP測(cè)量

移植4周后，暴露右頸外靜脈1 cm，3F嬰幼兒穿刺鞘管（美國(guó)COOK公司）進(jìn)行改良，頭部呈弧形彎曲，由頸外靜脈至前腔靜脈、右心房緩緩?fù)迫胗倚氖?，根?jù)壓力波形觀察測(cè)定RVSP。

1.3.5 心室比測(cè)量

測(cè)RVSP后處死大鼠，取出心臟，沿房室溝剪除心房組織，沿室間隔右心室邊緣分離右心室，用濾紙吸去血液，稱濕重，計(jì)算右心室/（左心室 +室間隔），并以此作為右心室肥大的指標(biāo)。

1.3.6 移植后肺組織形態(tài)學(xué)觀察

大鼠處死后由主支氣管灌注中性福爾馬林固定緩沖液，使肺組織膨脹固定20 m in，后切下肺組織浸泡中性福爾馬林液中，48 h后取材做石蠟切片，厚約5μm，每個(gè)肺組織標(biāo)本取5支肺泡水平肺小動(dòng)脈，行HE染色、平滑肌 actin免疫組化染色和彈力纖維地衣紅染色。彈力纖維染色圖片采用200倍光鏡觀察，采集圖像后分別測(cè)定內(nèi)、外彈力板的平均直徑，根據(jù)公式計(jì)算中膜厚度百分比［5］：WT％=（2 ×WT/ED）×100％。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0軟件，右心室壓力、心室重量比及肺小動(dòng)脈中膜厚度百分比均用 ±s表示，各個(gè)組值之間進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MSCs培養(yǎng)結(jié)果、鑒定

骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，約6～8 h可見(jiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁，呈圓形或多角形，2～3 d后可見(jiàn)細(xì)胞呈短梭形、短棒狀或星形；6～7 d左右見(jiàn)細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)，放射狀排列；約14 d細(xì)胞幾乎長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底，呈魚(yú)群、旋渦狀分布。傳代后的細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，多為梭形，貼壁快，24 h便可全部貼壁、伸展，呈均勻分布、增殖，3～4 d可見(jiàn)細(xì)胞融合生長(zhǎng)為單層。第3代MSCs表面標(biāo)記物CD29，CD44，CD34和CD45的陽(yáng)性率分別為 98.6％，78.2％，0.0％，0.3％（圖1）。

2.2 不同數(shù)量MSCs靜脈移植對(duì)正常大鼠RVSP的變化

圖1 MSCs表面標(biāo)志物流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of the marks of MSCs by flow cytometry

5×105個(gè)MSCs與生理鹽水對(duì)照組進(jìn)行大鼠靜脈內(nèi)移植是安全的，幾乎不導(dǎo)致明顯的RVSP的增加。注射1×106個(gè) MSCs到頸外靜脈5 min后，RVSP從（22.3 ±4.4）mmHg到（35.8 ±5.6） mmHg，30 min后 RVSP增加達(dá)到（44.2 ±4.5） mmHg；24 h后，RVSP為下降為（27.8 ± 3.6） mmHg，與生理鹽水對(duì)照組相比，會(huì)有殘存的壓力增加（圖2），但相對(duì)安全；但在移植5×106個(gè)MSCs 5 min內(nèi)有 2只死亡，剩余 3只 RVSP分別為 45.3 mmHg、49.4 mmHg和51.2 mmHg，24 h又一只死亡，剩余2只RVSP36.2 mmHg、41.3 mmHg，靜脈移植不安全。

2.3 移植后RVSP及心室比的改變

MCT組4周后 RVSP為（47.2±10.5）mmHg，心室比（0.4454±0.0935），而對(duì)照組4周后RVSP （25.2±4.0）mmHg，心室比（0.2348±0.0212），前者右心室壓力明顯增加（P＞0.05）、右心室肥厚（P ＞0.05）；MCT/MSCs 1×106組4周后RVSP為（35.6±8.4）mmHg，心室比（0.3572±0.0923）與MCT組相比均明顯下降（P＜0.05），而MCT/MSCs 5×105組 RVSP為（42.5 ±11.3）mmHg，心室比（0.4003±0.0725），與單純MCT組相比均下降不明顯（P＞0.05）（圖3和4）。

圖2 正常大鼠移植不同數(shù)目MSCs后不同時(shí)間右心室壓力的變化Fig.2 Changes of RVSP with time after different numbers of MSCs’transplantation in normal rats

圖3 MSCs移植后4周后右心室收縮壓的變化Fig.3 Changes of RVSP after four weeks of MSCs’transp lantation

圖4 MSCs移植后4周后右心室/ （左心室+室間隔）重量比的變化注：*表示差異顯著；△表示差異不顯著Fig.4 Changes of RV/（LV+S）ratio after four weeks of MSCs’transplantationNote：* significant difference；△ no significant difference

2.4 移植后肺組織病理變化

2.4.1 HE染色：

對(duì)照組肺動(dòng)脈管壁菲薄，內(nèi)皮細(xì)胞扁平連續(xù)，細(xì)胞分布均勻，大小厚薄較一致；MCT組肺小動(dòng)脈壁增厚伴玻璃樣變，管腔狹窄甚至閉塞，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主；小血管壁正常結(jié)構(gòu)喪失，有纖維素樣滲出，管周有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁上毛細(xì)血管淤血，肺間質(zhì)增厚；MCT/MSCs 1×106組與MCT組相比彈力纖維變薄，而MCT/MSCs 5×105組亦變薄，但無(wú)MCT/MSCs 1×106組明顯（彩插2圖5）。

2.4.2 平滑肌actin免疫組織化學(xué)染色：

正常對(duì)照組平滑肌染色，中層厚度很薄；MCT組中層平滑肌明顯增厚；MCT/MSCs 1×106組及MCT/MSCs 5×105組平滑肌actin染色均較MCT變薄（彩插2圖6）。

2.4.3 彈力纖維染色：

正常對(duì)照組肺腺泡內(nèi)小動(dòng)脈內(nèi)外彈力板（花邊樣）呈深棕色，中層不增厚，管腔無(wú)狹窄；MCT組中層增厚，管腔呈狹窄；MCT/MSCs 1×106組與 MCT組相比中層變薄，而MCT/MSCs 5×105組亦變薄，MCT/MSCs 1×106組明顯（彩插2圖7）。結(jié)果顯示，正常對(duì)照組肺小動(dòng)脈中層厚度百分比（10.1± 1.1）％，MCT組中層厚度百分比（26.4±4.9）％，MCT/MSCs 1×106組中膜厚度（19.2 ±3.8）％較MCT組明顯變?。≒ ＜0.05），而 MCT/MSCs 5× 105組中膜厚度（23.3 ±3.6）％與 MCT組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖8）。

圖8 MSCs移植后4周后肺小動(dòng)脈中膜厚度百分比.注：*表示差異顯著；△表示差異不顯著Fig.8 Percentage of wall thickness of the pulmonary arterioles after four weeks of MSCs’transplantationNote：* significant difference；△ no significant difference

3 討論

我們研究認(rèn)為采用5×105個(gè) MSCs、1×106個(gè)MSCs進(jìn)行頸外靜脈移植是安全的，不會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的血流動(dòng)力學(xué)變化。經(jīng)過(guò)頸外靜脈移植的細(xì)胞經(jīng)過(guò)前腔靜脈、右心房、右心室、肺動(dòng)脈到達(dá)肺微小動(dòng)脈，定植于此發(fā)揮作用。Campbell等［6］研究從靜脈移植細(xì)胞后，脾、肝和骨骼肌組織，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有熒光信號(hào)的細(xì)胞，細(xì)胞以高度選擇方式到阻力前毛細(xì)血管床，這正因?yàn)榉问巧淼慕馄蕿V器，相對(duì)大的粒子例如懸浮細(xì)胞會(huì)定植于肺的微血管，這對(duì)治療某一肺動(dòng)脈血管疾病非常有用。頸外靜脈移植細(xì)胞導(dǎo)致RVSP升高，是因?yàn)閼腋〖?xì)胞多，會(huì)導(dǎo)致肺微小動(dòng)脈的栓塞，從而使肺動(dòng)脈壓力及RVSP升高。因此較少的細(xì)胞形成的栓塞少所以影響小，而1×106個(gè)MSCs移植后RVSP升高后逐漸下降，可能是部分細(xì)胞與肺動(dòng)脈內(nèi)皮可黏附、遷移入血管內(nèi)腔，或移植細(xì)胞的丟失，導(dǎo)致肺小動(dòng)脈的栓塞減少而使 RVSP在24 h后下降。Sachiko等［7］認(rèn)為更多的細(xì)胞注射可能導(dǎo)致更多的肺小動(dòng)脈栓塞致RVSP急性嚴(yán)重升高，血流動(dòng)力學(xué)變化明顯以致循環(huán)不穩(wěn)定，所以死亡率較高。

Ortiz等［8］認(rèn)為骨髓間充質(zhì)細(xì)胞可以定植于博萊霉素?fù)p傷的肺，盡管觀察到的數(shù)量較少，但是該細(xì)胞展現(xiàn)了上皮細(xì)胞樣形態(tài)，降低肺部炎癥及膠原沉積，而且移植的細(xì)胞在肺組織中長(zhǎng)期存在，表現(xiàn)出高度的可塑性，并保留其分化基因的能力而發(fā)揮作用［9，10］。而移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究較少，Nagaya等［11］培養(yǎng)人臍帶血單核細(xì)胞，獲取的內(nèi)皮祖細(xì)胞，移植MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠左頸外靜脈，2周后，檢測(cè)到大鼠肺血管阻力下降16％，平均肺動(dòng)脈壓力下降14％。我們?cè)贛CT誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈高壓的同時(shí)進(jìn)行MSCs移植，發(fā)現(xiàn)1×106MSCs進(jìn)行靜脈內(nèi)移植，可以明顯降低RVSP，減輕了肺動(dòng)脈壓力升高導(dǎo)致的右心室肥厚，還可以使肺小動(dòng)脈中層厚度明顯變薄，不論從血流動(dòng)力學(xué)還是病理形態(tài)上均證實(shí)可以明顯抑制肺動(dòng)脈高壓形成的嚴(yán)重程度，而且較5×105個(gè)MSCs移植效果明顯。

關(guān)于干細(xì)胞移植對(duì)肺動(dòng)脈高壓作用機(jī)制復(fù)雜。首先，移植的干細(xì)胞可以整合到肺血管的內(nèi)皮細(xì)胞層，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)內(nèi)皮缺損。Nagaya等［11］靜脈移植表達(dá)綠色熒光蛋白的內(nèi)皮祖細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞可以摻和到MCT誘導(dǎo)大鼠的肺小動(dòng)脈和毛細(xì)血管中，分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞；其次，存在大量的證據(jù)證實(shí)骨髓來(lái)源的細(xì)胞具有刺激各種組織血管新生的能力，這主要通過(guò)基因標(biāo)志的骨髓移植得到的結(jié)論；再次，就是干細(xì)胞的自分泌和促進(jìn)臨近細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力。內(nèi)皮細(xì)胞可以像輸注巨噬細(xì)胞一樣可以分泌生長(zhǎng)因子，并不融合到血管，從而使缺血后側(cè)枝血流輕度增加［12］。

近年來(lái)，已有各種干細(xì)胞聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染治療肺動(dòng)脈高壓的報(bào)道。Zhao等［13］采用腹主動(dòng)脈-下腔靜脈分流法10周誘導(dǎo)大鼠肺動(dòng)脈高壓，分離人外周血內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染降鈣素基因相關(guān)肽，由大鼠頸外靜脈移植，4周后平均肺動(dòng)脈壓及總肺血管阻力均下降。因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈內(nèi)移植是治療肺動(dòng)脈高壓的良好嘗試，可以應(yīng)用于各種原因?qū)е碌姆蝿?dòng)脈高壓，是良好的種子細(xì)胞，還可以轉(zhuǎn)染基因增加治療的效果?？紤]到如此眾多的肺動(dòng)脈高壓患者，即使很少的個(gè)體受益，也會(huì)帶來(lái)明顯的影響。

［1］Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adultmarrow［J］.Nature，2002，418（6893）：41-49.

［2］Zhao YD， Courtman DW， Deng Y， et al. Rescue of monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension using bone marrow-derived endothelial-like progenitor cells［J］.Circ Res，2005，96（4）：442-450.

［3］何志旭，汪浩文，尚峰，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管病變的研究［J］.中國(guó)輸血雜志.2009，22（3）：180-184.

［4］Hayashi Y，Hussa JF，Lalich JJ.Corpulmonale in rats［J］.Lab Invest，1967，16（6）：875-880.

［5］劉斌，王獻(xiàn)民，魏麗，等.4種肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型肺血管重構(gòu)模式的差異研究［J］.中國(guó)病理生理學(xué)雜志，2008，24 （2）：289-293.

［6］Campbell AIM，Kuliszewski MA，and Stewart DJ.Cell-Based Gene Transfer to the Pulmonary Vasculature Endothelial Nitric Oxide Synthase Overexpression Inhibits Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension［J］.Am JRespir Cell Mol Biol，1999，21（5）：567-575.

［7］Sachiko KH，Hitoshi H，Shigetoshi M，et al.Implantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Endothelial Nitric Oxide Synthase Improves Right Ventricular Impairments Caused by Pulmonary Hypertension［J］.Circulation，2006，114（Sup.1）： I-181-I-185.

［8］Ortiz LA，Gambelli F，McBride C，et al.Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（14）：8407-8411.

［9］Grove JE，Lutzko C，Priller J，et al.Marrow-derived cells as vehicles for delivery of gene therapy to pulmonary epithelium［J］.Am JRespir Cell Mol Biol，2002，27（6）：645-651.

［10］Kotton DN，Ma BY，Cardoso WV，et al.Bone marrow-derived cells as progenitors of lung alveolar epithelium ［J］.Development，2001，128（24）：5181-5188.

［11］Nagaya N，Kangawa K，Kanda M，et al.Hybrid cell-gene therapy for pulmonary hypertension based on phagocytosing action of endothelial progenitor cells［J］.Circulation，2003，108（7）： 889-895.

［12］Ward MR，Stewart DJ，Kutryk MJ.Endothelial progenitor cell therapy for the treatment of coronary disease，acute MI，and pulmonary arterial hypertension： current perspectives［J］.Catheter Cardiovasc Interv，2007，70（7）：983-998.

［13］Zhao Q，Liu Z，Wang Z，et al.Effect of Prepro-Calcitonin Gene-Related Peptide-Expressing Endothelial Progenitor Cells on Pulmonary Hypertension［J］.Ann Thorac Surg，2007，84（2）： 544-552.