常用大鼠發(fā)熱模型研究

左澤平，王志斌，郭玉東，王碧松，高 陽(yáng)

（北京市藥品檢驗(yàn)所，北京 100035）

發(fā)熱是多種疾病常見的共有臨床表現(xiàn)，大多發(fā)熱性疾病患者的體溫曲線變化往往反映病情變化和病變的特點(diǎn)。近年來(lái)各種大鼠發(fā)熱模型的建立為解熱藥物的研究提供了重要依據(jù)。目前報(bào)道的常用大鼠發(fā)熱模型有干酵母、LPS、2，4-二硝基酚、角叉菜膠等發(fā)熱模型，其中最常用的是干酵母、LPS大鼠發(fā)熱模型。由于動(dòng)物自身特點(diǎn)和環(huán)境因素的綜合影響，不同文獻(xiàn)報(bào)道的同種發(fā)熱模型的發(fā)熱趨勢(shì)，如發(fā)熱高峰，峰值時(shí)間，發(fā)熱時(shí)程等各不相同。

為提高各種大鼠發(fā)熱模型的可利用度，深入研究不同發(fā)熱模型大鼠的發(fā)熱特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)中，采用適應(yīng)性較好、應(yīng)激反應(yīng)小的雄性SD大鼠在同一實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中（溫度22±2℃，濕度50％ ±2％），對(duì)大鼠干酵母、2，4-二硝基酚、LPS、細(xì)菌內(nèi)毒素（標(biāo)準(zhǔn)品）發(fā)熱模型的發(fā)熱過(guò)程，發(fā)熱特點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠，級(jí)別：SPF級(jí)；許可證號(hào)：SCXK（京）2006-0009，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：氯化鈉注射液，批號(hào)：

101217406，石家莊四藥有限公司；高活性干酵母粉，批號(hào)：20110104W，安琪酵母股份有限公司；細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（9000EU），批號(hào)：981，中國(guó)藥品生物制品檢定所；脂多糖（LPS），批號(hào)：

L2880，Sigma公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：TE2101-L電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；PB602-N電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；MC-106B歐姆龍電子體溫計(jì)（大連歐姆龍有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備：正式試驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)環(huán)境（溫度22℃ ±2℃，相對(duì)濕度50％ ±2％）中適應(yīng)3 d，每日早晚各一次對(duì)大鼠施行適應(yīng)性測(cè)量肛溫操作，實(shí)驗(yàn)前6 h禁食不禁水，測(cè)定肛溫前讓動(dòng)物排空糞便［1］。每次測(cè)溫前電子體溫計(jì)探頭涂凡士林，插入大鼠直腸3 cm（可在3 cm用橡膠或膠布等固定，確保每次插入深度一致），待讀數(shù)穩(wěn)定以后記錄體溫值。

1.2.2 皮下注射干酵母和2，4-二硝基苯酚復(fù)制大鼠發(fā)熱模型：雄性 SD大鼠60只，體重（210 g～240 g，于實(shí)驗(yàn)當(dāng)日在實(shí)驗(yàn)前測(cè)大鼠體溫3次，取其平均值作為基礎(chǔ)體溫，其中若體溫大于38.3℃或相鄰兩次體溫差值大于0.5℃的動(dòng)物淘汰。篩選出合格大鼠50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只：空白組皮下注射0.9％氯化鈉注射液（10 m L/kg）；干酵母A組皮下注射：20％現(xiàn)配的高活性干酵母混懸液（10 m L/kg）；干酵母 B組皮下注射10％現(xiàn)配的高活性干酵母混懸液（10 m L/kg）；2，4-二硝基苯酚A組皮下注射現(xiàn)配的2，4-二硝基苯酚30 mg/kg；2，4-二硝基苯酚 B組皮下注射現(xiàn)配的2，4-二硝基苯酚15 mg/kg，給藥體積均為10 m L/kg。干酵母A、B組分別在皮下注射干酵母混懸液0.5 h后開始監(jiān)測(cè)大鼠體溫，此后每間隔1 h監(jiān)測(cè)體溫1次，供監(jiān)測(cè)13 h，次日再測(cè)一次24 h體溫；2，4-二硝基苯酚A、B組分別在皮下注射后，前1 h每20 m in測(cè)溫1次，此后每0.5 h測(cè)溫1次，監(jiān)測(cè)7 h。計(jì)算各組各監(jiān)測(cè)點(diǎn)升溫值（實(shí)測(cè)體溫與基礎(chǔ)體溫差值），繪制平均升溫曲線；比較不同模型的發(fā)熱過(guò)程和特點(diǎn)。

1.2.3 腹腔注射細(xì)菌內(nèi)毒素和脂多糖復(fù)制大鼠發(fā)熱模型：按1.2.2項(xiàng)下方法測(cè)大鼠基礎(chǔ)體溫并篩選，篩選出的50只合格大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。空白組腹腔注射0.9％氯化鈉注射液（10 mL/kg）；內(nèi)毒素A組腹腔注射細(xì)菌內(nèi)毒素60 EU/kg；內(nèi)毒素B組腹腔注射細(xì)菌內(nèi)毒素120 EU/kg；脂多糖A組腹腔注射脂多糖20 ug/kg；脂多糖B組腹腔注射脂多糖100 ug/kg。細(xì)菌內(nèi)毒素A、B組和脂多糖A、B組分別在腹腔注射后0.5 h開始測(cè)溫，此后每0.5 h測(cè)溫1次，共監(jiān)測(cè)8 h；空白組在對(duì)應(yīng)模型的各個(gè)體溫監(jiān)測(cè)點(diǎn)均平行監(jiān)測(cè)。計(jì)算各模型各時(shí)間點(diǎn)升溫值（實(shí)測(cè)體溫與基礎(chǔ)體溫差值），繪制平均升溫曲線；比較不同模型的發(fā)熱過(guò)程和特點(diǎn)。各模型基礎(chǔ)體溫見表1。

表1 各模型大鼠基礎(chǔ)體溫值Tab.1 The value of basal body temperature in the rats

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 干酵母發(fā)熱模型

結(jié)果如圖1所示：SD大鼠皮下注射干酵母后，開始時(shí)體溫降低，A組（20％干酵母）最大降溫幅度為0.04℃（ΔT=-0.04℃），B組（10％干酵母）為0.32℃（ΔT=-0.32℃）。注射2 h后，大鼠體溫迅速上升，6～7 h達(dá)到峰值，A組峰值為2.25℃，B組峰值為2℃，此后升溫曲線處于峰值平臺(tái)期并能維持6 h。注射后12 h大鼠體溫開始下降，直至24 h升溫值才降至0.6℃以下。兩組大鼠升溫趨勢(shì)一致。注射干酵母后，隨體溫變化大鼠出現(xiàn)開始時(shí)體溫降低，足、唇蒼白，后隨體溫逐漸升高，均出現(xiàn)蜷縮，足部、耳廓、嘴唇尾深紅發(fā)燙，大部分大鼠有豎毛，趴伏，呼吸增快等現(xiàn)象。

2.2 2，4-二硝基苯酚發(fā)熱模型

如圖2所示：SD大鼠皮下注射2，4-二硝基苯酚后，體溫立即迅速增高，20 min即升至0.6℃以上。注射后1～1.5 h達(dá)到峰值，A組（30 mg/kg）峰值達(dá)到3.09℃；B組（15 mg/kg）峰值為1.48℃。此后體溫開始逐漸恢復(fù)，B組在注射后3h即監(jiān)測(cè)到體溫降至0.6℃以下，而A組則能維持到注射5h以后。兩劑量組大鼠升溫趨勢(shì)一致。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，A組大鼠在注射2，4-二硝基苯酚后隨體溫增高都出現(xiàn)了仰臥、流涎、呼吸急促、癱軟無(wú)力等癥狀，后隨著體溫逐漸下降，癥狀減輕至消失。B組則未出現(xiàn)明顯的以上癥狀。

2.2 LPS發(fā)熱模型

如圖3所示：腹腔注射 LPS（20μg/kg）30 min后，大鼠即出現(xiàn)體溫顯著升高，隨即在約2 h和4 h時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)高峰，最大峰值為1.13℃。注射后6 h監(jiān)測(cè)到體溫降至 0.6℃以下。大鼠腹腔注射 LPS（100 μg/kg）30 min時(shí)開始出現(xiàn)體溫顯著升高，隨后在2 h，4 h，6 h時(shí)出現(xiàn)3個(gè)高峰，呈現(xiàn)明顯的三相熱，最大發(fā)熱峰值為1.58℃，注射后8 h監(jiān)測(cè)到體溫降至0.6℃以下。在腹腔注射LPS后，A組（100μg/kg）大鼠產(chǎn)生三相熱過(guò)程中，出現(xiàn)豎毛、寒顫、精神萎靡，甚至伴有腹瀉等癥狀。B組（20μg/kg）大鼠也出現(xiàn)精神萎靡，寒顫等癥狀，但只有個(gè)別出現(xiàn)輕微腹瀉。

圖1 SD大鼠干酵母發(fā)熱模型升溫曲線Fig.1 The elevated temperature curves in the dry yeast-induced rat feaver models

圖2 SD大鼠2，4-二硝基苯酚發(fā)熱模型升溫曲線Fig.2 The elevated temperature curves in the 2，4-dinitrophenol-induced rat feavermodels

圖3 SD大鼠脂多糖（LPS）發(fā)熱模型升溫曲線Fig.3 The elevated temperature curves in the lipopolysaccharide-induced rat feavermodels

2.3 細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)熱模型

如圖4所示：腹腔注射細(xì)菌內(nèi)毒素后，A、B組均在30 m in即能檢測(cè)到體溫顯著升高，大鼠升溫呈現(xiàn)明顯的雙相熱，在1 h～1.5 h、3 h時(shí)出現(xiàn)高峰，最高峰值分別為0.99℃和0.93℃。注射后（4.5 h～5 h監(jiān)測(cè)到大鼠體溫降至0.6℃以下。注射細(xì)菌內(nèi)毒素后，發(fā)熱大鼠大部分出現(xiàn)寒顫、戰(zhàn)栗、豎毛等癥狀。

2.4 各發(fā)熱模型發(fā)熱過(guò)程及特點(diǎn)

如表2，從升溫起始時(shí)間看：2，4-二硝基苯酚發(fā)熱模型致熱最快，其次是LPS發(fā)熱模型和細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)熱模型。大鼠干酵母發(fā)熱模型開始時(shí)體溫小幅度降低，注射后2～3 h體溫開始迅速升高；從峰值出現(xiàn)時(shí)間看：干酵母發(fā)熱模型峰值出現(xiàn)時(shí)間較晚，在注射后6～7 h。其他三種發(fā)熱模型均在1 h～1.5 h即開始出現(xiàn)峰值。LPS和細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)熱模型呈現(xiàn)多項(xiàng)熱，有2～3個(gè)高峰；從最大峰值看： 2，4-二硝基苯酚（30 mg/kg）發(fā)熱模型峰值最高，干酵母發(fā)熱模型也較高，其次是 LPS發(fā)熱模型，而細(xì)菌內(nèi)毒素峰值不超過(guò)1℃；從發(fā)熱時(shí)程（以平均升溫值大于0.6℃為發(fā)熱標(biāo)準(zhǔn)看：發(fā)熱時(shí)程最長(zhǎng)的是干酵母模型，能持續(xù)20 h左右，發(fā)熱時(shí)程最短為2，4-二硝基苯酚（15 mg/kg）發(fā)熱模型，只能持續(xù)升溫3 h左右，LPS和內(nèi)毒素發(fā)熱模型能維持升溫5～8 h。

圖4 SD大鼠細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)熱模型升溫曲線Fig.4 The elevated temperature curves in the bacterial endotoxin-induced rat feaver models

表2 大鼠發(fā)熱模型體溫升高趨勢(shì)Tab.2 The trends of body temperature elevation in the ratmodels

3 討論

大多數(shù)發(fā)熱性疾病，體溫升高與體內(nèi)病變有著內(nèi)在的依賴關(guān)系，可以說(shuō)，發(fā)熱常是疾病發(fā)生和發(fā)展的信號(hào)，必須引起重視［2］。研究證明，發(fā)熱是由外致熱原刺激機(jī)體的產(chǎn)內(nèi)生致熱原細(xì)胞釋放內(nèi)生致熱原，后者作用于體溫正調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)中樞，釋放中樞正調(diào)節(jié)介質(zhì)，使體溫調(diào)定點(diǎn)上移，同時(shí)作用于相關(guān)體溫負(fù)調(diào)節(jié)中樞，釋放負(fù)調(diào)節(jié)介質(zhì)，抑制體溫過(guò)高［3-5］。

干酵母所致的發(fā)熱是由于注射部位的局部潰爛引發(fā)的劇烈炎癥反應(yīng)，是最常用的大鼠發(fā)熱模型［6］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：干酵母發(fā)熱模型大鼠經(jīng)過(guò)短時(shí)間降溫后體溫迅速增高，并能在高峰維持一個(gè)高峰平臺(tái)期，注射24 h后仍能觀察到注射局部有明顯的炎癥癥狀。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見兩組動(dòng)物發(fā)熱趨勢(shì)基本一致，且升溫幅度與注射的干酵母濃度呈正比，說(shuō)明干酵母致大鼠發(fā)熱模型升溫作用持久穩(wěn)定。在具體實(shí)驗(yàn)中，可根據(jù)受試藥物解熱作用強(qiáng)弱選用合適的干酵母濃度。結(jié)合干酵母所致大鼠發(fā)熱的原因及升溫特點(diǎn)，該模型應(yīng)適用于解熱作用持久，藥效較為顯著的解熱藥物研究。

2，4-二硝基酚為一強(qiáng)的代謝刺激劑，皮下注射2，4-二硝基酚能刺激動(dòng)物出現(xiàn)無(wú)菌性炎癥，為非感染性發(fā)熱模型［7］。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，2，4-二硝基酚所致大鼠發(fā)熱程度與熱程與其濃度呈正比。并且在發(fā)熱過(guò)程中，該模型大鼠出現(xiàn)的仰臥、流涎、呼吸急促、癱軟無(wú)力等癥狀與其升溫的幅度有直接關(guān)系，即升溫值越高，出現(xiàn)癥狀越明顯。2，4-二硝基苯酚作用迅速，短暫，升溫幅度高，不適用于作用緩慢、持久的解熱藥物解熱作用的考察，而適用于作用迅速，療效顯著，用于治療非感染性發(fā)熱的解熱藥物研究。

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素（ET）的活性成分，因此細(xì)菌內(nèi)毒素和LPS的致熱原理是一致的，即作為致熱原激活單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)生致熱原導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱。研究證實(shí)微量的 LPS就能引起劑量依賴性發(fā)熱，通常劑量（20～250μg/ kg）的LPS可引起雙相或三相熱，降低劑量則表現(xiàn)單相熱，解熱實(shí)驗(yàn)常用LPS劑量為20μg/kg和100 μg/kg［8，9］。本實(shí)驗(yàn)中 20μg/kg劑量致大鼠 0.5 h產(chǎn)生的發(fā)熱高峰可能是應(yīng)激性發(fā)熱，因此不考慮為第一相熱，即20μg/kg能致大鼠產(chǎn)生雙相熱，100 μg/kg能致大鼠產(chǎn)生三相熱。發(fā)熱整體趨勢(shì)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，但最大峰值的時(shí)間不同，初步判斷是由動(dòng)物品系和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境因素所導(dǎo)致。由于致熱原理一致，探索性建立大鼠細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)熱模型，其發(fā)熱特點(diǎn)為明顯雙相熱，但從升溫曲線看出細(xì)菌內(nèi)毒素高低劑量的升溫幅度差異很小，提示該模型的致熱作用在一定范圍內(nèi)與劑量呈正比，但超過(guò)一定范圍后加大劑量，大鼠升溫值可能并無(wú)明顯增幅，其原因有待進(jìn)一步研究。LPS發(fā)熱模型動(dòng)物升溫過(guò)程中，出現(xiàn)的癥狀的程度與發(fā)熱程度呈正比，其癥狀與臨床感染性炎癥所致發(fā)熱相似，因此該模型常用于解熱藥物篩選及炎性發(fā)熱機(jī)制的探討，可適用于抗炎抗病毒類解熱藥物解熱作用及機(jī)制的研究。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察到的100μg/kgLPS引起大鼠出現(xiàn)豎毛、寒顫、精神萎靡并伴有腹瀉等癥狀與升溫幅度并沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)，即升溫高或低都出現(xiàn)了上述癥狀。20μg/kg組大鼠也出現(xiàn)精神萎靡，寒顫等癥狀，但只有個(gè)別出現(xiàn)輕微腹瀉。

以上同種發(fā)熱模型組間比較看出，同種外致熱原所致發(fā)熱模型中，所用外致熱原濃度與升溫起始時(shí)間沒(méi)有明顯聯(lián)系，但可以明顯看出外致熱原濃度越高，發(fā)熱峰值出現(xiàn)時(shí)間延遲，發(fā)熱最大峰值越高，發(fā)熱時(shí)程延長(zhǎng)。解熱藥物研究中，選擇大鼠發(fā)熱模型應(yīng)綜合考慮藥物和模型特點(diǎn)。這其中要考慮：解熱藥的起效時(shí)間是否在模型升溫之后；解熱藥的作用時(shí)間是否在模型的熱程內(nèi)；解熱藥的藥效強(qiáng)度是否能適用于模型；解熱藥的解熱原理是否與模型的致熱原理相符。對(duì)于療效和作用特點(diǎn)不明確的藥物，建議選用熱程長(zhǎng)，且發(fā)熱穩(wěn)定的干酵母模型，以確保能檢測(cè)藥物解熱作用的全過(guò)程。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，正式實(shí)驗(yàn)前的適應(yīng)性測(cè)溫非常重要。大鼠在未適應(yīng)測(cè)溫操作之前，測(cè)得的體溫偏高，而在3～5 d，2～3次/d的適應(yīng)性測(cè)溫后，大鼠體溫穩(wěn)定，淘汰率很低。實(shí)驗(yàn)中測(cè)溫操作頻繁，加上造模后影響大鼠正常飲食，禁食時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響大鼠體溫，以6 h為宜。為確?；A(chǔ)體溫的準(zhǔn)確性，最好在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，先適應(yīng)性測(cè)溫一次，15～30 m in后再測(cè)基礎(chǔ)體溫。除溫度和濕度外，噪聲干擾會(huì)使大鼠體溫應(yīng)激性升高，因此在大鼠適應(yīng)期和正式實(shí)驗(yàn)中，都應(yīng)保持安靜的環(huán)境。所有的外致熱原，最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，放置過(guò)久會(huì)影響其致熱作用。在配置2，4-二硝基酚的過(guò)程中，因其在水中溶解度小，需要在配置過(guò)程中滴加少量5 mol/L NaOH震蕩至全溶，加入NaOH量過(guò)多則會(huì)刺激動(dòng)物而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

［1］章卓，萬(wàn)敬員，羅福玲，等.羥基積雪草苷與積雪草苷對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型的影響［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（8）：1799.

［2］黃啟福.病理學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2007：127.

［3］湯毅珊，王寧生，張銀卿.雄黃及含雄黃復(fù)方對(duì)炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α和NO的影響［J］.中藥藥理與臨床，2007，23（5）：107.

［4］顧學(xué)紅，任愛農(nóng)，彭蘊(yùn)茹，等.清氣涼營(yíng)注射液的解熱作用［J］.中成藥，2010，32（2）：200.

［5］葉紅，朱麗娜，馮甲棣，等.丁香酚對(duì)酵母菌發(fā)熱大鼠血漿及腦脊液中精氨酸加壓素含量的影響.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)［J］，2006，35（3）：260-264.

［6］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：993.

［7］黃志桓，柳長(zhǎng)鳳，劉樹民，等.基于代謝組學(xué)技術(shù)的2，4-二硝基苯酚和干酵母致熱病證候模型的對(duì)比研究［J］.中藥藥理與臨床，2010，26（3）：61.

［8］孫明瑜，高琳，謝鳴，等.小柴胡湯合煎液與分煎合液對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2003，10（12）：17-19.

［9］張福利，馮俏，馬伯艷，等.脂多糖對(duì)寒體、熱體、常體大鼠攻毒發(fā)熱后體溫曲線、IL-1β的影響［J］.江蘇中醫(yī)藥，2009，41（1）：76-77.