牛γ-干擾素在大腸桿菌中的表達(dá)及抗原性鑒定

劉巧榮，孫 明，喬明明，楊 璐，申屠芬琴，馬永纓，曹 振，田克恭，陳西釗，

（1.北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，北京 100085；2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100094）

研究意義：干擾素（interferon，IFN）是一種多效性細(xì)胞因子，主要由活化的 T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，具有廣泛抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)功能。根據(jù)產(chǎn)生干擾素的細(xì)胞來(lái)源、理化性質(zhì)及生物學(xué)活性的差異，哺乳動(dòng)物的干擾素可分為 5類，即 α、β、τ、ω及γ［1］。與其它型比，IFN-γ除具有抗病毒活性和抗腫瘤活性外，還有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性，能促進(jìn)MHC II類抗原表達(dá)、增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）與 T細(xì)胞的相互作用、增強(qiáng)輔助性T細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性T細(xì)胞產(chǎn)生的能力等，是機(jī)體發(fā)揮免疫功能，清除體內(nèi)病原體不可缺少的成分，因此，IFN-γ成為現(xiàn)代分子生物學(xué)，免疫學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

前人的研究進(jìn)展：Douglas等（1986）首先對(duì)BovIFN-γ進(jìn)行了原核表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組 BovIFN-γ蛋白在MDBK細(xì)胞系上的活性為 1.15×105U/m L。此后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者用大腸桿菌、畢赤酵母、皰疹病毒和桿狀病毒等表達(dá)載體對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)研究［2-6］。研究表明，BovIFN-γ在抗水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛白血病病毒以及副流感-3型病毒的試驗(yàn)中均取得了良好效果。另外，通過(guò)檢測(cè)牛血液中的 IFN-γ用于診斷牛結(jié)核病，目前已經(jīng)有BovIFN-γ檢測(cè)試劑盒出售［7］。

本研究切入點(diǎn)：本研究旨在應(yīng)用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)BovIFN-γ的高效表達(dá)，鑒定其抗原活性。為制備BovIFN-γ檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 載體和菌株

pGEM-T-Easy、PET-28a載體，購(gòu)自 Promega公司。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、dNTP和膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司，氨芐青霉素和IPTG購(gòu)自于Sigma公司。BovigamTM牛結(jié)核分枝桿菌 γ-干擾素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于北京測(cè)迪公司。BovIFN-γ酶標(biāo)單克隆抗體來(lái)自BovigamTM牛結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素檢測(cè)試劑盒。內(nèi)切酶Sal I和EcoR I為Takara公司產(chǎn)品。

1.3 目的基因克隆

參考GeneBank上BIFN-γ基因序列設(shè)計(jì)引物。上游引物：5＇-AGCGAATTCATGCAGGGCCAATTTT TTAGA-3＇，下游引物5＇-TTTGTCGACTTACGTTGAT GCTCTCCGGCCT-3＇。由寶生物工程大連有限公司合成。以人工合成的BIFN-γ基因序列為模板，克隆目的基因。

PCR擴(kuò)增程序：94℃ 4 m in，94℃ 30 s，50℃30 s，72℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)，72℃10 m in。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1％ 瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收?；厥债a(chǎn)物與 pGEM-T-Easy載體連接（方法參照Promega的產(chǎn)品使用說(shuō)明），PCR方法鑒定重組質(zhì)粒，并命名為pGEM-T-BIFN-γ。將鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

Sal I和 EcoR I雙酶切 pGEM-T-BIFN-γ質(zhì)粒，回收目的基因，連接至經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體PET-28a中；轉(zhuǎn)化到 BL21/DE3感受態(tài)細(xì)胞中。用PCR方法和雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒命名為PET-28a-BIFN-γ。

1.5 誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將PCR和酶切鑒定為陽(yáng)性的菌在LB/AMP中37℃培養(yǎng)，當(dāng)菌搖至 A600=0.8～1.0時(shí)，加入 IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，離心收集菌體。菌體經(jīng)過(guò)超聲波破碎，收集沉淀和上清液。沉淀用0.1％Triton X-100洗滌后，再用包涵體溶解液溶解。Ni-NTA親和層析法和電洗脫方法純化表達(dá)的重組蛋白。

1.6 SDS-PAGE和WesternBlot鑒定

將誘導(dǎo)菌液經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（NC膜）。5％脫脂奶粉封閉過(guò)夜，PBST洗滌3次，用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的抗BovIFN-γ單抗37℃孵育1h，洗滌3次后用二氨基聯(lián)苯胺（3，3＇-diam inobenzidine，DAB）顯色液顯色1～5 min，觀察結(jié)果。

1.7 ELISA檢測(cè)鑒定

將純化的BovIFN-γ重組蛋白作相應(yīng)倍數(shù)稀釋，作為待檢抗原和 γ-干擾素檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到預(yù)先包被BovIFN-γ抗體的酶標(biāo)板中，溫育1 h，洗滌3次，再加入酶標(biāo)抗 BovIFN-γ的單克隆抗體，溫育1 h，洗滌3次。加入底物顯色10 min，再加入終止液。450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的A值，判定陰陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增

以合成的BovIFN-γDNA序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的基因大小與預(yù)期大小一致（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示，克隆的基因片段大小為 429 bp，與M29867的序列完全相同。

圖1 BovIFN-γ的PCR結(jié)果1.Bov IFN-γgene；2：Negative control；M：DL 2000 markerFig.1 PCR products of BovIFN-γ

2.2 表達(dá)載體構(gòu)建

BovIFN-γ與表達(dá)載體 PET-28a連接轉(zhuǎn)化到BL21/DE3感受態(tài)細(xì)胞中。菌液PCR鑒定（圖2）顯示擴(kuò)增的基因大小與目的基因大小一致，重組質(zhì)粒PET-28a-BIFN-γ酶切結(jié)果見(jiàn)圖3。片段大小與預(yù)期結(jié)果一致，表明成功構(gòu)建原核表達(dá)載體。

2.3 PET-28a-BIFN-γ的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及WesternBlot鑒定

圖2 PET-28a-BIFN-γ菌液PCR鑒定M：DL 2000 marker；1：PET-28a-BIFN-γbacilli； 2：Negative controlFig.2 PCR identification of PET-28a-BIFN-γ

牛干擾素在 PET-28a中的表達(dá)情況以及Western Blot鑒定結(jié)果分別見(jiàn)圖4和圖5。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒在 E.coli BL21/DE3中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，分子量約為17 kDa左右。目的蛋白以包涵體和可溶性兩種形式存在，且以可溶性表達(dá)為主。經(jīng)Alpha成像儀掃描分析，表達(dá)蛋白約占菌體總蛋白的32％。菌體裂解上清經(jīng)Ni-NTA親和層析和電洗脫方法純化后得到純度較高的重組蛋白，濃度分別為0.56 mg/m L和2.6 mg/m L。Western blot鑒定結(jié)果表明兩種方法純化的牛干擾素蛋白均可和酶標(biāo)BovIFN-γ單克隆抗體反應(yīng)（圖5），具有很好的抗原反應(yīng)活性。

圖3 PET-28a-BIFN-γ酶切鑒定M：DL 2000 marker；1：Recombinantplasmids of PET-28a-BIFN-γ；Fig.3 Restriction enzyme digestion of PET-28a-BIFN-γ

圖4 PET-28a-r-BIFN表達(dá)情況M：Low molecular weight protein marker；1：Control without induction；2：Expressions of recombinant plasmid induced by IPTG；3：Products of bacterial lysate supernatant；4：Products of bacterial lysate precipitation；5：Affinity chromatography purfied protein；6：Electroelution purfied proteinFig.4 SDS-PAGE analysis of PET-28a-r-BIFN protein expressed in BL21

2.4 ELISA

用γ-干擾素檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)兩種純化的PET-28a-BIFN-γ重組蛋白。結(jié)果見(jiàn)表1，由表看出，電洗脫和親和層析純化的 BovIFN-γ濃度分別大于或等于0.13μg/m L和0.0056μg/m L時(shí)為陽(yáng)性。

表1 電洗脫與親和層析純化抗原ELISA檢測(cè)A450結(jié)果Tab.1 ELISA results of purfied protein determined by electroelution and affinity chromatography

圖5 Western Blot1：Protein purified by electroelution 2：Protein purified by affinity chromatographyFig.5 Western blot results

3 討論

BovIFN-γ可用于牛的一些病毒性疾病的防治，也可用于牛結(jié)核病的診斷［7，11］。牛結(jié)核病的 IFN-γ診斷法是1990年由Wood等建立，其原理是將試驗(yàn)牛的血液淋巴細(xì)胞培育，加入特異性抗原（如牛結(jié)核菌素，ESAT-6等）一起孵育16～24 h，感染牛結(jié)核的淋巴細(xì)胞釋放多量 IFN-γ，未感染牛結(jié)核的淋巴細(xì)胞不釋放或釋放少量 IFN-γ，通過(guò)檢測(cè)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ量的變化來(lái)診斷牛結(jié)核病。2000年世界牛分枝桿菌會(huì)議后，IFN-γ檢測(cè)方法在許多國(guó)家推廣使用，且己有檢測(cè)試劑盒出售。這種方法的敏感性和特異性較高，其敏感度可達(dá)93.6％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的皮內(nèi)試驗(yàn)65.6％的靈敏度［12］，且能檢測(cè)出早期感染牛分枝桿菌的牛，降低了傳染的風(fēng)險(xiǎn)［13］。可見(jiàn)IFN-γ檢測(cè)方法具有良好的應(yīng)用前景。

目前國(guó)內(nèi)外用于診斷牛結(jié)核病的檢驗(yàn)方法分為三類：第一類是細(xì)菌學(xué)方法，如涂片鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)等。鏡檢簡(jiǎn)便、快速，檢測(cè)的靈敏度低；細(xì)菌培養(yǎng)耗費(fèi)時(shí)間，檢測(cè)陽(yáng)性率低。第二類是免疫學(xué)方法，包括結(jié)核菌素變態(tài)反應(yīng)（TST）、ELISA和 γ干擾素檢測(cè)法等。TST是臨床上應(yīng)用最廣的方法，也是國(guó)際獸醫(yī)局推薦的牛結(jié)核病診斷的唯一方法。ELISA和γ干擾素實(shí)驗(yàn)法通過(guò)檢測(cè)結(jié)核菌的特異性抗體或細(xì)胞因子等，可檢出處于不同感染時(shí)期（潛伏感染期、疾病期）的牛，簡(jiǎn)便快速、檢測(cè)陽(yáng)性率較高。第三類是分子生物學(xué)方法，如PCR、核酸探針、基因芯片等，檢測(cè)的陽(yáng)性率高于細(xì)菌學(xué)方法，但檢出的病牛也已處于傳染期。故應(yīng)用 ELISA技術(shù)檢測(cè)BovIFN-γ以鑒定牛結(jié)核病的感染情況不失為一種快速、有效的方法。

本研究表達(dá)的重組蛋白主要以可溶性形式存在于菌體裂解上清中。試驗(yàn)用親和層析和電洗脫兩種方法純化重組蛋白，純化蛋白均能與試劑盒中的BovIFN-γ單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示Ni-NTA親和層析純化的BovIFN-γ與BovIFN-γ單克隆抗體的反應(yīng)活性明顯高于電洗脫方法純化的蛋白。如濃度為0.056 ug/m l親和層析法純化的BovIFN-γ仍與BovIFN-γ單克隆抗體呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)（A450值 =1.924），而相當(dāng)濃度（0.065 μg/m L）的電洗脫方法純化的蛋白與BovIFN-γ單克隆抗體呈陰性反應(yīng)（A450值 =0.120）。

本研究在大腸桿菌中成功表達(dá)了BovIFN-γ，純化的蛋白能被 BovIFN-γ單克隆抗體識(shí)別，其中 Ni-NTA親和層析純化蛋白的活性明顯高于電洗脫方法純化蛋白的活性。為制備抗 BovIFN-γ的單克隆抗體以及建立BovIFN-γ檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

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