Trizol RNA提取法在雪貂組織的流感病毒H3N2定量PCR檢測中優(yōu)于RNeasy mini kit （Qiagen）柱子法

占玲俊，鮑琳琳，李楓棣，呂 琦，許黎黎，秦 川

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

雪貂是研究流感感染的理想動物模型，由于其呼吸道上皮與人的呼吸道上皮相似，因此其感染的敏感性，傳播方式以及臨床癥狀與人感染的相似，常用于病毒的致病研究和疫苗的評價［1］。

檢測感染流感的雪貂病毒載量是流感的診斷，檢測和研究中常用的實驗技術(shù)，其靈敏度高，特異性好，方法快捷。尤其對高致病性流感的檢測和研究有重要用途，當感染樣品經(jīng)過初處理后，就不需要在ABSL-3實驗室進行操作，而可以轉(zhuǎn)到ABSL-2實驗室甚至是普通實驗室進行后續(xù)的定量檢測，免去了操作上的繁瑣和不便［1］。

熒光定量PCR系統(tǒng)體系是非常靈敏的體系，組織樣品的質(zhì)量，引物的特異性是決定 SYBR Green PCR定量結(jié)果可信度的關(guān)鍵。在準備定量 PCR的樣品模板時，有多種方法可以提取RNA，由于組織樣品的成分較復(fù)雜，不同組織的最優(yōu)提取方法會不同，另外不同試劑盒提取相同的組織RNA的質(zhì)量不同，去除PCR干擾因子比如基因組DNA，鹽份，糖份，某些未知的成分的情況也不同。

最常見的RNA提取方法是柱子法和有機試劑法，其中柱子法以 Qiagen公司的 RNeasy m ini kit （cat.74106）應(yīng)用最廣泛，該試劑盒針對液體樣品，培養(yǎng)的細胞系，小鼠和大鼠的組織研發(fā)，最常用于鼻咽拭子的流感病毒載量的檢測；QIAampViral RNA M ini Kit（Qiagen）用于咽拭子或者氣道灌洗液以及培養(yǎng)細胞的 RNA的提?。?］。有機試劑以經(jīng)典的Trizol最為推崇。

在本實驗室前期的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，對于雪貂的鼻甲刮取物或者灌洗液的病毒定量，RNeasy mini kit （cat.74106）提取的 RNA能完全滿足 SYBR Green PCR定量的要求，但是在雪貂組織如心、肝、脾、肺、腎、腸、腦等組織中，完全按該試劑盒提取方法提取的總RNA不能滿足后期的熒光定量要求，定量PCR的溶解曲線有時不能直接發(fā)現(xiàn)問題，通常只能通過產(chǎn)物的電泳才能判斷。

前期的動物組織病毒定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組織樣品中含有干擾熒光定量PCR的成分，因此，找到一個提取優(yōu)質(zhì)RNA，建立穩(wěn)定可靠的病毒 SYBR Green PCR定量方法非常有必要。

1 材料和方法

1.1 材料

RNeasy mini kit（Qiagen，74106）；Trizol （Invitrogen USA）， SuperScript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen，18080-051）；熒光染料Power SYBR Green PCR Master Mix（ABI，4367659）； Taq酶（TAKARA）；分子級無菌蒸餾水 （無RNA酶和DNA酶）。

1.2 方法

1.2.1取樣和組織勻漿：取3只攻毒感染的雪貂肺和腸組織，各稱取100 mg，分別放在1 m L RLT和Trizol中，用電動研磨器（PRO200，USA），功率選擇第3檔，1 min，將組織充分勻漿成懸液。另外，用刮匙在雪貂鼻甲上內(nèi)測刮取，將刮匙分別在DMEM中浸泡后得到懸液。

1.2.2 RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄［2］：RNA提取的4種方法如下：

經(jīng)典的Trizol法：將1 m L的Trizol裂解樣品按照經(jīng)典Trizol法提取RNA，最后的RNA樣品溶于50 μL無RNA酶的水中。

RNeasy mini kit柱子法：從1 mL的RLT樣品裂解液中取100μL樣品，按照該試劑盒的標準步驟提取RNA，溶于30μL無RNA酶的水中。

改良RNeasy mini kit柱子法1：從1 m L的Trizol樣品裂解液中取100μL樣品，按照RNeasy mini kit的標準步驟提取 RNA，溶于30μL無 RNA酶的水中。

改良RNeasy mini kit柱子法2：將1 mL的Trizol裂解樣品按加入200μL氯仿后從約500μL上清液中取100μL上清液作為樣品，按照RNeasy mini kit的標準步驟提取RNA，溶于50μL無RNA酶的水中。

將上述4種方法提取的RNA用Nano drop2000紫外分光光度儀測 RNA的濃度和純度，分別取2μL、8μL、8μL、8μL上樣，1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，180 V，8 min后在凝膠成像儀中觀看RNA電泳條帶。

根據(jù) RNA電泳的質(zhì)量，取適量 RNA用SuperScript III First-Strand Synthesis System （Invitrogen，18080-051）進行逆轉(zhuǎn)錄，取轉(zhuǎn)錄后的cDNA模板做后面的熒光定量PCR。

1.2.3 SYBR Green定量PCR［3，4］

取逆轉(zhuǎn)錄的模板2μL，按照ABIPOWER SYBR Green Mix反應(yīng)體系加樣，

Stepone定量 PCR儀上機。H3N2的引物分別為H3N2-353-F：5＇-GAA TCT GGC GGC AAG CCA AC-3＇；H3N2-540-R：5＇-ACC TGC AGC TCC GGA CCT TC-3＇。逆轉(zhuǎn)錄的特異性引物為H3N2-RT：5＇-AGC AAA AGC AGG-3＇。按照以下循環(huán)參數(shù)進行熒光定量 PCR反應(yīng)：94℃，3 min；94℃，30 s，58℃，30 s，72℃ ，30 s，然后95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s；35個循環(huán) 。

由上述引物PCR擴增病毒液，PCR產(chǎn)物電泳后切膠，用膠回收試劑盒 （Qiagen，MinElute Gel Extraction Kit）回收特異性產(chǎn)物條帶，紫外分光光度儀測定回收產(chǎn)物的濃度，利用公式（6.02×1023拷貝數(shù)/摩爾）x（濃度g/m L）/（MW g/mol）=copies/ m L計算標準品的拷貝數(shù)值。

定量PCR的產(chǎn)物1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀中觀看產(chǎn)物的條帶情況。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取的結(jié)果

按前述的方法提取雪貂組織的總RNA，測核酸濃度和純度見表1，雪貂的肺和腸的組織總RNA電泳，得到 RNA質(zhì)量的電泳圖（圖1），可見經(jīng)典的Trizol法提取的RNA有3條帶，28 s，18 s和5 s，而RNeasy mini kit柱子法的RNA中有基因組污染，改良RNeasy mini kit柱子法1和2提取的RNA只有28 s和18 s帶。

雪貂鼻甲刮取物的病毒懸液RNA只用紫外分光光度儀測濃度和純度。

2.2 病毒的SYBRGreen熒光定量PCR

根據(jù)組織塊重量以及RNA電泳條帶亮度分別取2μL，8μL，8μL，8μL總RNA，而鼻甲刮取物直接取8μL的總 RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen）進行逆轉(zhuǎn)錄，然后取2μL等量的 cDNA模板進行SYBR Green熒光定量 PCR，結(jié)果如圖2。其中，鼻甲和組織的定量PCR的溶解曲線均為與標準品波峰位置重合的單一峰。

表1 四種方法提取的組織RNA的濃度和純度的比較Tab.1 Comparison of the concentration and purity of RNA isolated by the four methods

圖1 4種方法提取的雪貂的肺和腸組織的總RNA電泳圖Note：The left Fig.re：Lane1-4：Total RNA isolated from lung by RNeasy mini kit，modified RNeasy mini kit2，modified RNeasymini kit1，Trizol，respectively.The right Fig.re： Lane1-4： Total RNA isolated from intestines by RNeasy mini kit，modified RNeasy mini kit2，modified RNeasymini kit1，and Trizol.Fig.1 Total RNA run in the 1.5％agarose gel electrophoresis

將上述定量 PCR產(chǎn)物在1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳，發(fā)現(xiàn)鼻甲和組織定量的結(jié)果如下：鼻甲刮取物的產(chǎn)物是與標準品大小一致的單一的特異性條帶，而組織中只有經(jīng)典的 Trizol法提取的組織定量是與標準品一致的特異性條帶，而其它3種方法提取的模板則均有非特異性條帶，結(jié)果見圖3。

2.3 4種方法的總結(jié)［5］

根據(jù)RNA提取的質(zhì)量，后期PCR產(chǎn)物的特異性，操作過程的時間，試劑盒的成本，比較總結(jié)如表2：

圖2 定量的溶解曲線Note：2A shows themelting curves of the turbinate samples.Curve 1-5：standard，Trizol，modified RNeasymini kit2，modified RNeasy mini kit1 and RNeasy mini kit，respectively.2B shows the melting curves of the lung and intestine samples.Curves 1-5 are standard，modified RNeasymini kit2，modified RNeasymini kit1，RNeasymini kit，and Trizol for the lung tissues.Curves6-9 aremodified RNeasymini kit2，modified RNeasymini kit1，RNeasymini kit，and Trizol for the intestinal tissues.Fig.2 Melting curves of SYBR Green real time PCR quantification

3 討論

病毒感染的動物組織，由于其成分較復(fù)雜，尤其是空腔臟器腸中含有各種干擾定量PCR成分較多，如基因組DNA，鹽份，糖份，酶等PCR抑制因子因此前期 RNA的質(zhì)量和除干擾時重要的一環(huán)［7］。RNA提取一般用柱子法和有機試劑方法，參考國外文獻［1，6-7］，某些專門實驗室推薦 RNeasy m ini kit柱子法，而另外實驗室有機方法 Trizol法。本實驗室為選擇合適的RNA提取方法滿足后期的熒光定量PCR體系，對經(jīng)典的Trizol法，RNeasy mini kit柱子法，改良RNeasy m ini kit柱子法1和改良RNeasy mini kit柱子法2進行比較。

圖3 SYBR Green real time PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Note：3A shows the products of the turbinate samples.Lanes 1-5 are： modified RNeasy mini kit2，modified RNeasy mini kit1，RNeasy mini kit，Trizol and standard，respectively.3B shows the products of lung and intestine samples.Lanes 1-5 are： lung tissues assayed with standard，modified RNeasy mini kit2，modified RNeasy mini kit1，RNeasy mini kit，and Trizol，respectively.Lanes 6-9 are intestine samples assayed with modified RNeasy mini kit2，modified RNeasy mini kit1，RNeasy mini kit，and Trizol.Fig.3 Products of SYBR Green real time PCRrun in 1.5％agarose gel electrophoresis

除了組織RNA和cDNA的質(zhì)量，引物的特異性也很關(guān)鍵，由于雪貂的基因背景目前無公布的信息，因此選擇合適的引物去掉組織的非特異結(jié)合也很重要。因此，對于簡單樣品鼻甲刮取物，經(jīng)典的 Trizol法、RNeasy m ini kit柱子法、改良RNeasy m ini kit柱子法1和改良 RNeasy m ini kit柱子法2提取的RNA質(zhì)量均可，在病毒的SYBR Green熒光定量 PCR中均能產(chǎn)生特異性的擴增。另外也說明這4種提取方法的試劑體系均不對SYBR Green熒光定量 PCR產(chǎn)生干擾，引物的特異性好。

組織的RNA提取，4種方法提出的RNA質(zhì)量不同。雖然總RNA的質(zhì)量并不能完全代替組織中病毒RNA的質(zhì)量，但是能作為操作質(zhì)控。紫外分光光度儀測出A260/280除了RNeasy mini kit柱子法的值低于1.8，說明可能有基因組DNA污染，其余3種方法均在1.8～2.1之間，A260/230只有Trizol法能到達2.0左右，其余3種方法均遠低于2.0，說明這3種可能有鹽分等物質(zhì)的污染。說明完全按照試劑盒的步驟對于去除雪貂的基因組效果比較差，可能需要加大裂解液的量或者減少組織量。RNA電泳電圖可見Trizol法提出來的RNA電泳3條帶最完整，并且無基因組DNA污染，RNA樣品在后面的熒光定量PCR有特異性擴增，并且無任何干擾雜帶。只是該方法耗時比較長，并且需要在冰上操作。而RNeasy m ini kit柱子法提取的 RNA可見28 s和18 s帶，不見5 s帶，有基因組DNA污染，后期的定量PCR產(chǎn)物為多帶，結(jié)果不可信。改良RNeasy mini kit柱子法1和改良RNeasy mini kit柱子法2提取的RNA電泳均只能見到28 s和18 s帶，無基因組污染，而定量PCR產(chǎn)物為多帶，并也可見目的條帶的擴增，其中改良 RNeasy m ini kit柱子法2的產(chǎn)物雜帶較少，目的帶比較清楚。

可見，Trizol在裂解組織樣品時，其去除基因組DNA的能力強于RNeasy mini kit中的RLT裂解液，并且經(jīng)典Trizol提取的RNA純度最好，對定量PCR的干擾最小。RNeasy mini kit柱子法提取的 RNA中混有的基因組DNA或者其它雜質(zhì)對定量的干擾較大。而改良法1和改良法2雖然能去除基因組DNA和某些干擾成分，但仍殘留有其他的雜質(zhì)，并對定量反應(yīng)產(chǎn)生干擾。

由此可見，對于雪貂的組織樣品，Trizol法得到的定量結(jié)果最可信，而其它的3種方法的結(jié)果在SYBR Green熒光定量PCR不太可信。雖然RNeasy mini kit柱子法在組織總 RNA提取中很被推崇，但是需要優(yōu)化才適合本實驗室的定量體系。

表2 4種RNA提取方法在組織病毒定量中應(yīng)用的比較Tab.2 Comparison of the quantification of influenza H3N2 virus assayed with the four RNA isolation methods and Syber Green real time PCR

［1］Matsuoka Y，Lamirande EW，Subbarao1 K.The Ferretmodel for influenza［M］.Curr Protoc Microbiol，2009，Chapter 15，Unit 15G.2.

［2］楊楠，徐正進，周永力，等.改良Trizol法提取高質(zhì)量稻曲病菌總RNA的方法［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008，11：145-146.

［3］Bao LL，Xu LL，Zhan LJ，et al.Challenge and polymorphism analysis of the novel A（H1N1）influenza virus to normal animals［J］.Virus Res，2010，151（1）：60-65.

［4］Liu S，Hou GY，Zhuang QY，et al.A SYBR Green I real-time RT-PCR assay for detection and differentiation of influenza A （H1N1）virus in swine populations［J］.JVirol Methods，2009，（168）：184-187.

［5］Tomaso H，Kattar M，Eickhoff M，et al.A comparison of commercial DNA preparation kits for the detection of Brucellae in tissue using quantitative real-time PCR［J］.BMC Infect Dis，2010，10：1-5.

［6］Spackman E，Suarez DL.Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material［J］.Methods Molec Biol.436：13 -18.

［7］Das A，Spackman E，Pantin-Jackwood MJ，et al.Removal of real-time reverse transcription polymerase chain reaction（RTPCR）inhibitors associated with cloacal swab samples and tissues for improved diagnosis of avian influenza virus by RT-PCR［J］.J Vet Diagn Invest，2009，21：771-778.