大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施環(huán)境微生物和塵埃粒子的動(dòng)態(tài)監(jiān)控

王 晶，劉 偉，袁水娟，談小倩，謝 恩，徐 平，芮 榮

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；2.中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，3.上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，上海 201615）

大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障系統(tǒng)環(huán)境的穩(wěn)定是保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)?；a(chǎn)、供應(yīng)和動(dòng)物質(zhì)量的基本條件。屏障系統(tǒng)內(nèi)的環(huán)境微生物控制與其生產(chǎn)種群的來(lái)源、空氣潔凈度、物品的消毒或滅菌以及人員的進(jìn)出和操作等有關(guān)。在現(xiàn)行的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施與環(huán)境國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB14925—2001)中，只規(guī)定了靜態(tài)狀況下屏障系統(tǒng)應(yīng)該達(dá)到的基本條件或標(biāo)準(zhǔn)［1］，而對(duì)動(dòng)態(tài)運(yùn)行中的屏障系統(tǒng)沒(méi)有作出明確的規(guī)定。在生產(chǎn)型屏障系統(tǒng)中，屏障內(nèi)落下菌與塵埃粒子的變化會(huì)因動(dòng)物飼養(yǎng)種類，密度，飼養(yǎng)工作的不同而呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)選擇兩個(gè)飼養(yǎng)不同品種動(dòng)物的屏障系統(tǒng)，在不同時(shí)間段對(duì)屏障系統(tǒng)進(jìn)行空氣落下菌與塵埃粒子的測(cè)定，研究生產(chǎn)型屏障系統(tǒng)動(dòng)態(tài)環(huán)境下微生物和塵埃粒子的變化規(guī)律，并分析生產(chǎn)活動(dòng)對(duì)環(huán)境指標(biāo)的影響，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障系統(tǒng)動(dòng)態(tài)環(huán)境的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)儀器與試劑

直徑9 cm的塑料培養(yǎng)皿，超凈工作臺(tái)，顯微鏡，生化培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋，電子天平，恒溫水浴鍋，F(xiàn)LUKE983激光粒子計(jì)數(shù)器，不銹鋼傳遞罐，冰箱，無(wú)菌工作衣及無(wú)菌手套等。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(上?？禎?rùn)生物科技有限公司);瓊脂粉(上海盛思生化科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)場(chǎng)所環(huán)境及飼育方式

1.2.1 屏障系統(tǒng)等級(jí)及環(huán)境：清潔級(jí)屏障系統(tǒng)［Ⅰ］：小鼠飼養(yǎng)屏障，全部飼養(yǎng)小鼠，測(cè)定地點(diǎn)選擇該屏障小鼠飼養(yǎng)室及潔凈走廊和污物走廊。清潔級(jí)屏障系統(tǒng)［Ⅱ］：大鼠和兔飼養(yǎng)屏障，其中有兔飼育室，和大鼠飼育室，分別測(cè)定兔飼育室和大鼠飼育室。

屏障系統(tǒng)［Ⅰ］和［Ⅱ］，單個(gè)飼育室容積172 m3，房間頂部進(jìn)風(fēng)口6個(gè)，四角回風(fēng)口4個(gè)。屏障設(shè)施保持環(huán)境條件為：溫度(22±2)℃，濕度(50± 10)%，照明為晝夜交替各12 h。通風(fēng)換氣次數(shù)為15次/h左右。

1.2.2 飼育方式：飼養(yǎng)生產(chǎn)工作時(shí)間為7∶00～15∶00，實(shí)驗(yàn)期間噴霧消毒［2］時(shí)間為13∶00。大小鼠采用塑料籠具飼養(yǎng)，顆粒飼料飼喂，單獨(dú)水瓶飲水，每日更換部分籠具。添加飼料及更換水瓶。小鼠籠底板面積0.042 m2，籠內(nèi)高度0.13 m，室內(nèi)采用飼育架多層放置，小鼠房間放置小鼠籠1 728個(gè)，小鼠飼育密度10籠/m3，大鼠籠底板面積0.09 m2籠內(nèi)高度0.18 m，大鼠房間放置大鼠籠600個(gè)，飼育密度約為3.5籠/m3，兔采用雙層鐵籠飼養(yǎng)，底板面積0.45 m2，籠內(nèi)高度0.42 m，兔房放置兔籠288個(gè)，飼育密度約為1.67籠/m3。

1.3 落下菌與塵埃粒子的采集

普通瓊脂培養(yǎng)皿和激光粒子計(jì)數(shù)器于超凈臺(tái)紫外線照射20 min后，用無(wú)菌密封袋密封，用酒精噴霧消毒后從傳遞窗傳入。采樣人員經(jīng)過(guò)沐浴后穿著無(wú)菌隔離衣，無(wú)菌隔離腳套，戴無(wú)菌口罩和無(wú)菌手套后進(jìn)入。

培養(yǎng)皿放置位置：動(dòng)物房一條對(duì)角線上取3點(diǎn)，正中一處，兩邊距墻1 m各放一個(gè)，清潔走廊，污染走廊等間距放置3個(gè)。放置方法：放置于地面，平板蓋打開(kāi)，扣放于平板旁，計(jì)時(shí)30 min。塵埃粒子采樣方法：使用激光粒子計(jì)數(shù)器測(cè)定粒子濃度直徑≥0.3μm粒子濃度，采樣器放置高度1 m，采集空氣體積設(shè)定1 L。

放置時(shí)間：00∶00，06∶00，11∶00，16∶00，樣品重復(fù)采集3次。

1.4 樣品處理

1.4.1 動(dòng)物房落下菌數(shù)量分析：采集好的培養(yǎng)皿放入37℃生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24～48 h，取出于超凈臺(tái)中計(jì)錄菌落數(shù)，屬于相同房間的培養(yǎng)皿加權(quán)取平均值為平均菌落數(shù)。采用SPSS分析軟件［3］分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.4.2 空氣塵埃粒子數(shù)統(tǒng)計(jì)：從激光粒子計(jì)數(shù)器讀取空氣中直徑≥0.3μm塵埃粒子數(shù)量，采用 S PSS分析軟件分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 落下菌落數(shù)量分析

屏障系統(tǒng)1內(nèi)清潔走廊、污物走廊工作日落下菌數(shù)量在11∶00時(shí)均顯著高于其余時(shí)間(P＜0.05)，在其它三個(gè)時(shí)間差異不顯著(P＞0.05)。小鼠飼育室工作日落下菌數(shù)量在11∶00時(shí)顯著高于06∶00時(shí)和16∶00時(shí)(P＜0.05)，與00∶00時(shí)差異不顯著(P＞0.05)，小鼠飼育室工作日落下菌數(shù)量在00∶00時(shí)、06∶00時(shí)和16∶00時(shí)三個(gè)時(shí)間差異都不顯著（P＞0.05）。

屏障系統(tǒng)1內(nèi)清潔走廊、污物走廊休息日落下菌數(shù)量在各時(shí)間段差異均不顯著（P＞0.05）。小鼠飼育室在休息日落下菌數(shù)量各時(shí)間點(diǎn)差異均不顯著（P＞0.05）。（表1）。

屏障系統(tǒng)2兔飼育室工作日落下菌數(shù)量在11∶00時(shí)均顯著高于其余時(shí)間（P＜0.05），在其它三個(gè)時(shí)間差異不顯著（P＞0.05）。大鼠飼育室工作日落下菌數(shù)量在11∶00時(shí)顯著高于06∶00時(shí)和16∶00時(shí)（P＜0.05），在16∶00時(shí)顯著低于00∶00時(shí)和06∶00時(shí)（P＜0.05），00∶00時(shí)與06∶00之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 直徑≥0.3μm塵埃粒子數(shù)量分析

屏障系統(tǒng)2兔飼育室休息日落下菌數(shù)量在各時(shí)間段差異均不顯著（P＞0.05）。大鼠飼育室休息日落下菌數(shù)量在各時(shí)間段差異均不顯著（P＞0.05）。（表2）。

屏障系統(tǒng)1內(nèi)清潔走廊、污物走廊工作日塵埃粒子數(shù)在11∶00時(shí)均顯著高于其余時(shí)間（P＜0.05），在其它三個(gè)時(shí)間差異不顯著（P＞0.05）。小鼠飼育室工作日塵埃粒子數(shù)在11∶00時(shí)顯著高于其余時(shí)間（P＜0.05），在00∶00時(shí)顯著高于06∶00時(shí)和16∶00時(shí)（P＜0.05）。

屏障系統(tǒng)1內(nèi)清潔走廊、污物走廊休息日塵埃粒子數(shù)在各時(shí)間段差異均不顯著（P＞0.05）。小鼠飼育室休息日塵埃粒子數(shù)在00∶00時(shí)顯著高于其余時(shí)間（P＜0.05），在06∶00時(shí)顯著高于11∶00時(shí)（P＜0.05），11∶00時(shí)和16∶00時(shí)差異不顯著（P＞0.05）（表3）。

屏障系統(tǒng)2兔飼育室工作日塵埃粒子數(shù)在11∶00時(shí)均顯著高于其余時(shí)間（P＜0.05），在16∶00時(shí)顯著高于00∶00時(shí)（P＜0.05），00∶00時(shí)與06∶00時(shí)差異不顯著（P＞0.05）。大鼠飼育室工作日塵埃粒子數(shù)在16∶00時(shí)顯著低于其余時(shí)間（P＜0.05），在其它三個(gè)時(shí)間差異不顯著（P＞0.05）。

屏障系統(tǒng)2大鼠飼育室休息日塵埃粒子數(shù)在各時(shí)間段差異均不顯著（P＞0.05）兔飼育室休息日塵埃粒子數(shù)在11∶00時(shí)均顯著高于其余時(shí)間（P＜0.05），在16∶00時(shí)顯著高于00∶00和06∶00時(shí)（P＜0.05），00∶00時(shí)與06∶00時(shí)差異不顯著（P＞0.05）。（表4）。

表1 屏障系統(tǒng)1內(nèi)小鼠飼育室和潔凈與污物走廊落下菌的檢測(cè)結(jié)果字典Tab.1 Detection of airfall bacteria in the mice room and corridor of barrier systemⅠ

表2 屏障系統(tǒng)2內(nèi)大鼠飼育室與兔飼育室落下菌的檢測(cè)結(jié)果字典Tab.2 Detection of airfall bacteria in the rat room and rabbit room of barrier systemⅡ

表3 屏障系統(tǒng)1內(nèi)小鼠飼育室和潔凈與污物走廊塵埃粒子的檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Detection of dust in the m ice room and corridor of barrier systemⅠ

表4 屏障系統(tǒng)2內(nèi)大鼠飼育室與兔飼育室字典塵埃粒子的檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Detection of dust in the rat room and rabbitroom of barrier systemⅡ

3 討論

在符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的靜態(tài)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障系統(tǒng)引入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育群后，屏障系統(tǒng)內(nèi)各項(xiàng)環(huán)境和空氣微生物指標(biāo)均會(huì)發(fā)生明顯的變化。潔凈走廊，污物走廊和動(dòng)物飼育室內(nèi)落下菌和塵埃粒子數(shù)量均會(huì)升高，但由于動(dòng)物生產(chǎn)的周期性和動(dòng)物生活習(xí)性的相對(duì)固定，落下菌和塵埃粒子又隨著晝夜和不同生產(chǎn)時(shí)間產(chǎn)生規(guī)律性的變化。

屏障系統(tǒng)［Ⅰ］內(nèi)潔凈走廊、污物走廊和小鼠飼育室和屏障系統(tǒng)［Ⅱ］內(nèi)大鼠飼育室和兔飼育室內(nèi)在工作日落下菌數(shù)量11∶00時(shí)均顯著高于06∶00時(shí)和16∶00時(shí)，表明飼養(yǎng)活動(dòng)可使屏障內(nèi)落下菌與塵埃粒子數(shù)明顯升高，人的飼養(yǎng)管理操作，如更換籠器具、配種、離乳、添加飼料等工作，可以增加落下菌與塵埃粒子的數(shù)量，這與實(shí)驗(yàn)型屏障系統(tǒng)變化規(guī)律不同，實(shí)驗(yàn)型屏障生產(chǎn)系統(tǒng)工作量較小，落下菌數(shù)量相對(duì)較低［4］。而潔凈走廊、污物走廊、小鼠飼育室、大鼠飼育室和兔飼育室內(nèi)落下菌數(shù)量在16∶00時(shí)明顯降低，表明飼養(yǎng)結(jié)束后噴霧消毒可使屏障內(nèi)落下菌與塵埃粒子數(shù)明顯下降，噴霧形成的大量液滴在空氣中會(huì)黏附大量塵埃粒子，由于重力作用很快降落到地面上，減少了空氣中落下菌與塵埃粒子的數(shù)量。大小鼠飼育室在00∶00時(shí)落下菌和塵埃粒子數(shù)量較高，表明屏障內(nèi)大、小鼠夜間活動(dòng)較多，這與大、小鼠屬于夜行性動(dòng)物的行為特癥有關(guān)。屏障系統(tǒng)［Ⅰ］內(nèi)污物走廊內(nèi)落下菌與塵埃粒子數(shù)始終高于潔凈走廊，主要原因是潔凈走廊由于其空氣壓力梯度最高，排風(fēng)能力強(qiáng)，細(xì)菌和塵埃含量始終保持在一個(gè)較低的水平。污物走廊在工作日則由于開(kāi)門、門縫及壓差等緣故，使飼育室內(nèi)的細(xì)菌與塵埃粒子進(jìn)入，造成污物走廊細(xì)菌和塵埃粒子數(shù)量升高。

屏障系統(tǒng)［Ⅱ］中大鼠飼育室內(nèi)的空氣落下菌和塵埃粒子數(shù)量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于兔飼育室和屏障系統(tǒng)1中小鼠飼育室。其原因在于：大、小鼠均為塑料飼育籠內(nèi)鋪設(shè)木屑?jí)|料籠養(yǎng)，但大鼠的體型和活動(dòng)量均大于小鼠，且飼料、飲水和排泄物都多于小鼠，大鼠的活動(dòng)可以使時(shí)飼養(yǎng)籠中的細(xì)菌和塵埃更多的漂浮在空氣中。

在屏障系統(tǒng)［Ⅰ］和［Ⅱ］中，污物走廊、小鼠飼育室、兔和大鼠飼育室內(nèi)落下菌和塵埃粒子數(shù)量均高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB14925—2001對(duì)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施的要求，

其中大鼠飼育室都在100個(gè)/皿以上，而小鼠和兔飼育室在100個(gè)/皿以下，其中小鼠飼養(yǎng)室與張華瓊等報(bào)道的結(jié)果動(dòng)物飼養(yǎng)間空氣落下菌數(shù)可控制在100個(gè)/皿以下一致［5］。而潔凈走廊除工作日11∶00外，落下菌數(shù)量均在3個(gè)/皿以下?？梢?jiàn)，動(dòng)態(tài)屏障系統(tǒng)內(nèi)各功能區(qū)域落下菌與塵埃粒子數(shù)量與區(qū)域功能，工作狀態(tài)和動(dòng)物品種有關(guān)。因此，在實(shí)際生產(chǎn)和環(huán)境監(jiān)測(cè)中中，應(yīng)根據(jù)飼養(yǎng)的動(dòng)物種類、密度和飼養(yǎng)方式和不同功能區(qū)域來(lái)分別制定相應(yīng)的落下菌和塵埃粒子監(jiān)控指標(biāo)。

空氣中的塵埃粒子的數(shù)量多少可以直接反映空氣的潔凈程度，在屏障系統(tǒng)中，空氣經(jīng)過(guò)預(yù)初效，初效，中效，高效四級(jí)過(guò)濾后進(jìn)入，對(duì)于直徑≥0.3 μm的塵埃，可達(dá)到99.97％的過(guò)濾效果［6，7］。屏障中塵埃粒子主要來(lái)源為動(dòng)物和人的活動(dòng)，通過(guò)對(duì)空氣中塵埃粒子的監(jiān)測(cè)，可以間接反映動(dòng)物與人的活動(dòng)情況，而空氣中的微生物一般附著在塵埃粒子上，塵埃粒子濃度的變化可以間接反映飼育室內(nèi)空氣細(xì)菌量的變化。塵埃粒子對(duì)動(dòng)物和人的影響大部分是通過(guò)呼吸道引起的，少量是通過(guò)皮膚、眼及粘膜。直徑小于2.5μm的塵埃粒子可以直接進(jìn)入肺部導(dǎo)致疾病發(fā)生?？諝庵袘腋〉膲m埃粒子數(shù)量分布又呈現(xiàn)一定的規(guī)律，在動(dòng)態(tài)屏障系統(tǒng)空氣中直徑≥0.3μmm的塵埃粒子數(shù)最多，且變化較明顯，故本研究選擇直接≥0.3μm塵埃粒子作為空氣潔凈度指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)屏障系統(tǒng)空氣潔凈變化程度。

屏障系統(tǒng)［Ⅰ］和［Ⅱ］中各功能區(qū)域直徑≤0.3 μm塵埃粒子數(shù)量都顯著高于靜態(tài)屏障，且不同功能區(qū)域與不同飼養(yǎng)室之間塵埃粒子濃度不同。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)生產(chǎn)型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施內(nèi)的空氣落下菌與塵埃粒子進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)屏障系統(tǒng)各功能區(qū)域空氣落下菌與塵埃粒子變化有一定規(guī)律性，且變化在一定范圍內(nèi)，在實(shí)際生產(chǎn)中，如果細(xì)菌數(shù)量或者塵埃粒子遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于平均值，則有可能發(fā)生了管理上的問(wèn)題、動(dòng)物微生物控制質(zhì)量下降或者設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)出現(xiàn)故障等，這對(duì)于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施的動(dòng)態(tài)運(yùn)行，制定屏障設(shè)施動(dòng)態(tài)環(huán)境控制參數(shù)以及屏障設(shè)施的維護(hù)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量的監(jiān)控都有積極的參考意義。

［1］國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.GB14925—2001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施［S］.2001.26-28.

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［3］翟青新，沈黎，瞿葉清，等.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施靜態(tài)與動(dòng)態(tài)空氣落下菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果分析［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2008，25（3）：39 -41.

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