四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝性腦病模型的制備

劉 冀，朱建忠，隋月林，劉 鋒

（1.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖學(xué)和組織胚胎學(xué)教研室，滄州 061000； 2.河北醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)和組織胚胎學(xué)教研室，石家莊 050017）

肝性腦病 （hepatic encephalopathy，HE）是以各種嚴(yán)重肝臟疾病所致的代謝紊亂為基礎(chǔ)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）功能失調(diào)綜合癥，以神經(jīng)精神癥狀為主，臨床表現(xiàn)為意識(shí)障礙、記憶學(xué)習(xí)能力下降、行為異常、昏迷，可有撲翼樣震顫，構(gòu)音障礙，出現(xiàn)病理反射，血氨升高，特征性腦電圖異常（高幅慢波）［1］。HE是肝臟解毒功能不全和衰竭表現(xiàn)，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。一般認(rèn)為是肝細(xì)胞功能衰竭與門靜脈因手術(shù)造成的或者是自然形成的側(cè)支分流有關(guān)。主要來自腸道的多種毒性代謝產(chǎn)物，未被肝臟解毒、消除，經(jīng)過側(cè)支進(jìn)入體循環(huán) ，透過血腦屏障而至腦部，引起大腦功能紊亂。多認(rèn)為是多種因素綜合作用的結(jié)果，目前存在多種致病學(xué)說，其中氨中毒致HE學(xué)說已被廣泛接受。在實(shí)驗(yàn)性肝性腦病的研究中，肝性腦病動(dòng)物模型復(fù)制的方法很多，但多有其相對局限性。為此，建立合適穩(wěn)定的動(dòng)物模型就非常重要。然而，迄今為止尚無滿意的慢性肝功能衰竭引起HE發(fā)生的模型，通常的動(dòng)物模型研究多以行為學(xué)觀察為主，缺乏可靠的定量指標(biāo)和綜合性分析。為此，我們選擇四氯化碳聯(lián)合酒精自飲的方法制作慢性肝功能衰竭引起HE發(fā)生的模型，并進(jìn)行多項(xiàng)指標(biāo)的檢測和分析。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

健康W istar大鼠50只，3～4月齡，體重150～200 g（合格證編號1003066）。

1.2 藥品和試劑

四氯化碳（CCl4），合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠；橄欖油，上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠（將 CCl4溶于橄欖油配制40％CCl4橄欖油溶液）；食用乙醇，深圳市華昌化工有限公司；戊巴比妥鈉，上海瑞齊生物科技有限公司

1.3 儀器

Morris水迷宮，自然基因科技有限公司產(chǎn)品；自動(dòng)生化檢測儀 （Olympus，Au560）；全自動(dòng)血氨檢測儀（日本Ammonia-CheckerⅡ型）；HEL-LIGE八道生理記錄儀，日本生產(chǎn)（腦電圖）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 制作肝性腦病模型：雄性 W istar大鼠50只購自河北醫(yī)科大學(xué)河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重150～200 g，大鼠隨機(jī)分成2組即造模組和正常對照組。造模組（n=40）給予40％CCl4、橄欖油混合溶液腹部皮下注射，（CCl4∶橄欖油 =1∶2.5），5％乙醇自來水溶液自飲。首次給藥每只鼠 0.5 m L/ 100 g，以后每只0.3 mL/100 g，每周注射2次，共9周；對照組正常喂養(yǎng)，普通飲水，晝夜節(jié)律喂養(yǎng)，每周腹下注射生理鹽水2次，9周后成模。在造模過程中記錄動(dòng)物體重、外觀指標(biāo)、死亡率和死亡數(shù)，同時(shí)觀察行為活動(dòng)狀態(tài)，特別是神經(jīng)系統(tǒng)的功能狀態(tài)，死亡動(dòng)物做完記錄后予以剔除。

1.4.2 步驟：實(shí)驗(yàn)開始前所有動(dòng)物均進(jìn)行 Morris水迷宮測試，建立水迷宮逃避潛伏期之后按完全隨機(jī)的方法抽出10只大鼠作為正常對照組，剩余40只進(jìn)入造模組，造模組大鼠按復(fù)合因素造成肝硬化的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)第九周（肝硬化晚期）將造模組和對照組大鼠進(jìn)行水迷宮測試和腦電圖（EEG）測試，記錄逃避潛伏期，并觀察腦電圖（EEG）有無肝性腦病的典型髙幅慢波。HE的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）模組大鼠Morris水迷宮測試值大于對照組x+2.5 s；（2） EEG測試有典型肝性腦病髙幅慢波者；（3）出現(xiàn)典型HE行為、情緒者。HE模型建立。

1.4.3 Morris水迷宮測試方法：將水注入直徑130 cm、高50 cm的圓形不透明水箱中，水深25 cm、水溫（26±1）℃。水中加適量奶粉使水保持不透明狀態(tài)。測試前1 d將大鼠放入水箱中進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。測試時(shí)，將大鼠面朝池壁置于水箱中以測量其發(fā)現(xiàn)水下1.5 cm處平臺(tái)（8 cm×8 cm）的能力。連續(xù)測試5 d，每天訓(xùn)練兩組次，9：00和17：00時(shí)各一組次，每一組次訓(xùn)練8次。觀察指標(biāo)為發(fā)現(xiàn)并爬上平臺(tái)時(shí)間（逃避潛伏期），取每一組次的平均值進(jìn)行比較。如果大鼠在120 s內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，則將大鼠置于平臺(tái)上，60 s后拿離迷宮，其搜索平臺(tái)的時(shí)間記為120 s。

1.4.4 腦電圖的測試方法：大鼠在1％戊巴比妥鈉（45 mg/kg體重）腹腔麻醉下，俯臥固定，安置額枕骨間電極，鼻根部及雙耳分別接地線，用16導(dǎo)腦電圖機(jī)測定，并用電腦描記腦電圖，時(shí)間常數(shù)0.3，高頻濾波100 Hz。固定、調(diào)試好儀器，安裝電極，單極導(dǎo)聯(lián)描記，于安靜狀態(tài)下進(jìn)行描記，記錄腦電圖，連續(xù)觀察10 m in，觀察振幅與頻率。振幅為波頂?shù)讲ǖ组g的垂直高度，代表腦部電位活動(dòng)的大?。活l率為同一周期的腦電波在1 s內(nèi)重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)。1.4.5 血液生化檢測：全部大鼠在灌注前，水合氯醛麻醉后剪開胸腔 ，用一次性注射器無菌心臟穿刺采血5 m L。其中取1 mL置于無熱原肝素管中迅速用全自動(dòng)血氨分析儀測血氨 （BA）；取2 m L全血，分離血漿后以全自動(dòng)生化分析儀測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （ALT）、總膽紅素 （TBil）、尿素氮 （BUN）。1.4.6 病理檢查：取大鼠肝臟同一葉肝組織一片 ，以4％中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋并且片，HE染色后光鏡觀察。

1.5 檢測指標(biāo)

水迷宮逃避潛伏期；EEG；生化指標(biāo)；切片；動(dòng)物活動(dòng)情緒行為觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件對水迷宮逃避潛伏期進(jìn)行單因素方差分析；血液生化應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮測試成績

50只正常大鼠中隨機(jī)抽出10只作為對照組，與預(yù)行造模的造模組（40只）比較兩組逃避潛伏期無顯著差別（P＞0.05），具有可比性；第九周對照組潛伏期較造模前略延長，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該組大鼠無一例潛伏期延長超過造模前建立的正常值x+ 2.5 s；造模組中有15只潛伏期明顯延長，超過正常x+2.5 s，且EEG出現(xiàn)慢波，歸入HE組，HE組潛伏期與對照組比較潛伏期明顯延長（P＜0.01）（見表1）。

2.2 各組大鼠腦電圖的變化

除1只大鼠未出現(xiàn)典型肝性腦病的EEG特征性外，其余實(shí)驗(yàn)組大鼠EEG均出現(xiàn)肝性腦病所特有的髙幅慢波。（見圖1，2）

表1 Morris水迷宮潛伏期變化（±s，s）Tab.1 The changes of escape latency of Morris watermaze（±s）test.unit：second

表1 Morris水迷宮潛伏期變化（±s，s）Tab.1 The changes of escape latency of Morris watermaze（±s）test.unit：second

#P＞0.05 *P＜0.01

動(dòng)物組Groups造模前Before modeling造模后第九周9 wks after modeling正常組 Normal group（10）13.02±1.14 13.57±1.36模型組 Model group（14） 14.13±1.28# 30.23±4.9*

2.3 血液生化指標(biāo)

結(jié)果顯示，模型組大鼠 ALT（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶）、TBil（總膽紅素）、BUN（尿素氮）及 BA（血氨）水平平均比正常組明顯升高，差異分別有非常顯著性（P＜0.01），說明模型組有嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷和氨中毒。（表2）

圖1 正常大鼠腦電圖Fig.1 The electroencephalograph（EEG）of a normal rat

圖2 HE大鼠腦電圖Fig.2 The electroencephalograph（EEG）of a hepatic encephalopathy rat

2.4 肝病理表現(xiàn)

肉眼下可見模型組大鼠肝臟普遍腫大，表面較粗糙，有較粗的顆粒，暗紅色；正常組大鼠肝臟則未見異常。光鏡下觀察，正常組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整 ，肝板條索狀以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞無變性、壞死；模型組大鼠肝組織經(jīng) HE染色，見肝細(xì)胞溶解，彌漫性大片壞死 ，殘留肝細(xì)胞成片氣球樣變。

2.5 行為學(xué)觀察

模型組大鼠平均體重在造模過程中表現(xiàn)為先升高后降低（4～5周后開始下降），并逐步表現(xiàn)為精神不振、厭食、嗜睡、體形消瘦等。從第6周開始，部分大鼠先后表現(xiàn)為活動(dòng)減少、嗜睡、捕捉反應(yīng)、疼痛反應(yīng)遲鈍等，并且已開始出現(xiàn)死亡大鼠。第七周大鼠多數(shù)出現(xiàn)精神萎靡、呆滯、活動(dòng)明顯減少、步態(tài)蹣跚、自主性活動(dòng)減少、捕捉反應(yīng)更加明顯、疼痛反應(yīng)更加遲鈍甚至消失，個(gè)別出現(xiàn)昏迷、死亡大鼠增多（最終死亡率為50％：20/40）。而對照組大鼠體重持續(xù)上升，活動(dòng)正常。

表2 肝性腦病模型組與對照組大鼠血液生化指標(biāo)的比較（±s）Tab.2 Changes of serum biochem istry parameters of the 2 groups（±s）

表2 肝性腦病模型組與對照組大鼠血液生化指標(biāo)的比較（±s）Tab.2 Changes of serum biochem istry parameters of the 2 groups（±s）

注：與正常組相比 *P＜0.01。Note：vs.normal group，*P＜0.01.

組別Groups 數(shù)量 ALT（IU/L） TBiL（IU/L） BUN（mm l/L） BA（mg/L）正常組Normal 10 60±12.3 9.7±5.0 5.2±1.1 1.0±0.2模型組Model 14 1340.4±299.7* 74.8±19.6* 8.4±3.1* 4.5±2.3*

3 討論

3.1 HE大鼠模型建立的設(shè)計(jì)思路與依據(jù)

肝性腦病的發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，在多種學(xué)說中以氨中毒學(xué)說的研究為多，而其他可能的機(jī)制仍需要深入的、全面的研究。為此，建立合適穩(wěn)定的動(dòng)物模型就非常重要。肝性腦病動(dòng)物模型的制作方法主要有三種：手術(shù)造模、藥物造模、藥物合并手術(shù)造模，其中手術(shù)造模用于制作急性肝衰性 HE模型，而藥物造模用于制作慢性肝功能衰竭引起HE發(fā)生的模型［2］。目前，國內(nèi)外尚無成熟的慢性肝功能衰竭引起HE發(fā)生的模型，通常的動(dòng)物模型研究多以行為學(xué)觀察為主，缺乏可靠的定量指標(biāo)和綜合性分析。為此，我們選擇四氯化碳腹下注射聯(lián)合酒精自飲方法制作慢性肝功能衰竭引起HE發(fā)生的模型，對動(dòng)物HE模型的發(fā)生進(jìn)行探索，并進(jìn)行多項(xiàng)指標(biāo)的檢測和分析。一般將動(dòng)物模型制作后的一段時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)萎靡、嗜睡、反應(yīng)遲緩、自主性活動(dòng)減少、共濟(jì)失調(diào)、昏迷等癥狀之一，即可診斷為 HE。有時(shí)也可輔以檢測動(dòng)物腦電圖、血氨水平，以及進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)檢查（如病理或電鏡檢查）等［3］。本實(shí)驗(yàn)通過對動(dòng)物行為、肝病理表現(xiàn)、腦電圖、水迷宮測試等項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行觀察，結(jié)果表明 HE造模成功。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹谱骶哂幸韵聝?yōu)點(diǎn)：（1）Morris水迷宮測試是經(jīng)典的反映動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知能力的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)并且操作簡單；（2）腦電圖測試是最重要的反映神經(jīng)系統(tǒng)和大腦功能的方法［4，5］；（3）復(fù)合因素造成實(shí)驗(yàn)性肝硬化大鼠模型是成熟的造模方法，更接近人類疾病模型。所以本實(shí)驗(yàn)關(guān)于HE模型的設(shè)計(jì)思路具有動(dòng)物行為學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)依據(jù)，并與HE患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)有較好的符合性，因而具有科學(xué)性。

3.2 Morris水迷宮測試的意義

Morris水迷宮（Morriswatermaze，MWM）是英國心理學(xué)家Morris于1982年設(shè)計(jì)的，最初是檢測海馬損害動(dòng)物定位航行實(shí)驗(yàn)的重要工具，后來作為檢驗(yàn)空間、學(xué)習(xí)、記憶的實(shí)驗(yàn)手段，成為行為神經(jīng)科學(xué)常用的實(shí)驗(yàn)室工具之一［6］。空間辨別性學(xué)習(xí)記憶是檢測空間定向、反應(yīng)時(shí)間，視知覺和結(jié)構(gòu)應(yīng)用等能力，從而評價(jià)其認(rèn)知水平的一種行為模式，是一類關(guān)于場景和事件的學(xué)習(xí)記憶。簡單地說，需要?jiǎng)游锇芽臻g方位周圍的物體作為參照物，經(jīng)過反復(fù)識(shí)認(rèn)，從而在其腦內(nèi)將參照物同空間方位聯(lián)系起來，借助參照物來獲得辨別該空間方位的能力。建立空間辨別性學(xué)習(xí)記憶動(dòng)物模型的方法較多，雖然裝置各異，但基本原理多是讓動(dòng)物對利用空間信息作出正確的選擇，其中大多裝置以電擊為刺激，使動(dòng)物獲知哪一方位是傷害源，從而避開，優(yōu)點(diǎn)是簡便易行，缺點(diǎn)是以電擊為刺激因素，盡管其程度和時(shí)間是可控的，但畢竟是一種傷害，使動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)。而水迷宮法是利用動(dòng)物急于逃離水的本能反應(yīng)為刺激，與電擊相比對動(dòng)物的影響要小得多，而且該行為模型是一種空間記憶的模型，與海馬功能有關(guān)；另外，MWM在研究學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)化學(xué)原理方面比其他幾種方法具有優(yōu)勢，特別是涉及區(qū)分記憶結(jié)構(gòu)缺陷的感覺、運(yùn)動(dòng)、動(dòng)機(jī)和再現(xiàn)過程等方面［7］。海馬、紋狀體、基底前腦，大腦和小腦皮質(zhì)等損害均可導(dǎo)致MWM成績下降，且該成績能反映不同腦區(qū)及不同神經(jīng)遞質(zhì)相互作用、整合的情況以及神經(jīng)系統(tǒng)能量代謝的狀態(tài)。MWM檢測成為評估認(rèn)知功能缺陷和神經(jīng)認(rèn)知功能處于何種狀態(tài)的重要方法。所以本實(shí)驗(yàn)采用MWM訓(xùn)練大鼠，使其獲得辨別空間方位的能力，并利用此模型來研究大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。本研究采用四氯化碳、酒精自飲復(fù)合因素造成的實(shí)驗(yàn)性肝硬化大鼠模型，結(jié)果顯示：造模前對照組與造模組兩組潛伏期比較無顯著差別（P＞0.05），具有可比性；第九周造模組中有15只（75％）逃避潛伏期延長超過正常x+2.5 s說明此時(shí)（肝硬化晚期）這部分大鼠學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知力出現(xiàn)障礙

3.3 HE大鼠動(dòng)脈血氨濃度變化的意義

正常人體內(nèi)氨的生成和清除保持著動(dòng)態(tài)平衡，嚴(yán)重肝病時(shí)，由于氨的來源、生成、吸收增加以及清除不足，引起血氨增加［8，9］。據(jù) Norenberg等報(bào)道，高血氨破壞了血腦屏障的完整性［10］；McClung等發(fā)現(xiàn)，氨灌注使血腦屏障的微孔由7.3人擴(kuò)大到8.5； Lockwood等［11］發(fā)現(xiàn)肝衰竭時(shí)腦對氨的滲透表面積增加。因此，推斷在外周血循環(huán)中血氨的增高可以累及腦組織，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠血氨較正常組明顯增多從而證實(shí)了血氨在HE時(shí)升高，說明血氨升高是HE發(fā)病機(jī)制之一。但也有一些研究對此提出異議，首先，血氨檢測并未出現(xiàn)一致性升高，有個(gè)別大鼠血氨值表現(xiàn)為正常，其可能處于代償期內(nèi)。另外也有個(gè)別樣本血氨值甚至出現(xiàn)顯著低于其正常值下限，提示 HE發(fā)生時(shí)未必均伴有血氨升高，提示肝性腦病的發(fā)生機(jī)制可能相當(dāng)復(fù)雜，氨中毒學(xué)說或許只是諸多機(jī)制中的一個(gè)方面，很有可能還存在其他的重要機(jī)制，例如是否存在氨、硫醇和短鏈脂肪酸的協(xié)同毒性作用、是否有假性神經(jīng)遞質(zhì)的參與、是否存在氨基酸代謝的不平衡等機(jī)制，這一切都有待于進(jìn)一步探討，所以不能僅憑血氨水平來判斷HE的發(fā)生。

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