不同品系小鼠感染甲型流感病毒肺小血管內(nèi)血栓形成

劉 穎，徐艷峰，鄧 巍，朱 華，黃 瀾，馬春梅，鮑琳琳，秦 川

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室）

急性肺動脈栓塞（pulmonary embolism，PE）是指內(nèi)源性或外源性栓子堵塞肺動脈引起肺循環(huán)障礙的臨床和病理生理綜合征，臨床觀察和多項(xiàng)種群研究的證據(jù)顯示靜脈血栓栓塞VTE已經(jīng)成為一種全球性嚴(yán)重的醫(yī)療保健問題。近年來眾多學(xué)者提出深靜脈血栓一肺栓塞DVT-PE是由于遺傳和（或）環(huán)境異常造成的一種多基因、多因素性疾病，并將外傷、手術(shù)、高齡、惡性腫瘤、妊娠、心衰、制動及口服避孕藥等列為其發(fā)生的危險(xiǎn)因素。另外臨床實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明流行性感冒與急性的肺動脈栓塞風(fēng)險(xiǎn)增加之間雖然還沒有明確的相關(guān)關(guān)系［1］，但已有流感病毒感染導(dǎo)致血栓形成的病例報(bào)道。2009年10月Agarwal等［2］報(bào)告的15例甲型H1N1流感者CT檢查中有5例肺栓塞。本研究使用不同免疫狀態(tài)的小鼠感染甲型流感病毒（H1N1和H3N2），觀察病毒感染后血栓形成的情況。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雌性4～6周 BALB/C小鼠（40只）和 NODScid小鼠（50只），雌性4～6周Scid小鼠，BALB/C-nu小鼠，NOD/LtJ小鼠（各33只）（由北京華阜康提供，合格證號：SCXK京 2009）；icosl-KO小鼠（10只）（由衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）。小鼠按品系分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前3 d安置于生物實(shí)驗(yàn)安全實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具（IVC）中適應(yīng)環(huán)境，H1N1病毒感染實(shí)驗(yàn)在 BSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，H3N2病毒感染實(shí)驗(yàn)在BSL-2實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

1.2 病毒

H1N1病 毒 A/California/7/2009（CA7）株，TCID50為 106。H3N2病毒 A/Brisbane/10/07株，TCID50為107。

1.3 病毒感染

H1N1病毒以106TCID50，對BALB/C小鼠、Scid小鼠、NOD/LTJ小鼠、BALB/C-nu小鼠、NOD-Scid小鼠和icosl-KO小鼠經(jīng)乙醚麻醉后進(jìn)行滴鼻攻毒，每只小鼠50μL，攻毒后每天觀察小鼠，分別于第4天、第6天、第7天、第8天和第14天處死小鼠取材檢測小鼠感染后的肺組織病毒載量和病理改變。實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所ABL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

H3N2病毒以107TCID50，對BALB/C小鼠、Scid小鼠、NOD/LTJ小鼠、BALB/C-nu小鼠、NOD-Scid小鼠和icosl-KO小鼠經(jīng)乙醚麻醉后進(jìn)行滴鼻攻毒，每只小鼠50μL，觀察期為14 d。分別于攻毒后第3天、第10天和第14天處死小鼠取材檢測感染后的肺組織病毒載量和病理改變。實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所ABL-2實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

1.4 動物犧牲及標(biāo)本處理

斷頸處死小鼠，打開胸腔，保留肺組織：取右上肺葉于組織裂解液中用于提取組織RNA；取右中肺葉于凍存管置-80℃冰箱中備份保存；其余肺葉與心、肝、脾、腎、腦、胃腸道等組織于10％中性甲醛溶液中固定。

1.5 肺組織總RNA提取及PCR檢測

RNeasy Mini Kit試劑盒（QIAGEN，74106）提取肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用熒光染料Power SYBR Green PCR Master Mix（ABI，4367659）進(jìn)行realtime PCR檢測（ABI STEPONE PCR儀）。擴(kuò)增程序94℃3 min；94℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，共35個循環(huán)；95℃，15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。每次試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品作106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/m L、102copies/m L濃度梯度稀釋，陰性對照（H2O）與樣品一起提取RNA后做real-time PCR。通過讀取儀器數(shù)據(jù)得到病毒載量。

所用 H1N1亞型特異性引物為 SW-H1 F786 5’-AATAACATTAGAAGCAACTGG-3’， SW-H1 R920 5’-AGGCTGGTGTTTATRGCACC-3’，目的片段大小為153 bp；H3N2亞型特異性引物為 BR-10F 5’-GAGAATCCAGCACACAAGAG-3’，BR-10R 5’-TTCTCAGTTCAAGAGTGCTC-3’，目的片段大小為196 bp。

1.6 病理學(xué)檢查

10％中性甲醛溶液固定組織常規(guī)石蠟包埋，常規(guī)組織學(xué)處理，常規(guī)HE染色。肺組織切片纖維素特殊染色（Mallory磷鎢酸蘇木素改良染色，即PTAH改良染色），抗P選擇素抗體（北京瀚天科技有限公司提供）免疫組織化學(xué)染色。

2 結(jié)果

2.1 小鼠感染后存活情況和大體觀察

小鼠感染H1N1病毒后逐漸出現(xiàn)進(jìn)食減少、消瘦、被毛逆立、弓背、反應(yīng)遲鈍等，感染小鼠后感染死亡情況見表1、表2。剖檢時(shí)可見感染小鼠肺臟有明顯的充血和水腫，肺組織表面有局部實(shí)變，其他臟器未見明顯改變。

表1 H1N1感染小鼠后觀察到血栓形成的小鼠/取材小鼠和感染死亡情況，（單位：只）Tab.1 Observed number ofmice with thrombosis and number of dead m ice infected with H1N1 virus

表2 H3N2感染小鼠后觀察到血栓形成的小鼠/取材小鼠和感染死亡情況，（單位：只）Tab.2 Observed number ofmice with thrombosis and number of dead m ice infected with H3N2 virus

小鼠感染H3N2病毒后，一般狀態(tài)尚好，未見明顯的食欲減退和活動減少，觀察14 d均無死亡。剖檢時(shí)各品系感染小鼠肺臟均未見明顯的充血水腫，肺組織顏色正常，未見實(shí)變等改變，其他臟器未見明顯改變。

2.2 小鼠肺組織病毒載量檢測結(jié)果

攻毒后不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠取肺組織RT-PCR檢測流感病毒的表達(dá)量（表3、表4），各組小鼠均染毒。

表3 H1N1感染不同品系小鼠肺組織不同時(shí)間的病毒拷貝數(shù)Tab.3 Virus copy number in mice infected with H1N1 virus

表4 H3N2感染不同品系小鼠肺組織不同時(shí)間的病毒拷貝數(shù)Tab.4 Virus copy number in m ice infected with H3N2 virus

2.3 小鼠肺組織病理觀察結(jié)果

H1N1感染小鼠肺部病變較重，肺間質(zhì)血管高度充血，肺泡間隔度增寬、融合，少量炎細(xì)胞浸潤，其中BALB/C小鼠和Scid小鼠病變面積較大。13只小鼠肺組織小血管內(nèi)見血栓形成（圖1A、B）（血栓形成的小鼠數(shù)和取材小鼠數(shù)見表1）。其他臟器未見異常改變。

H3N2感染小鼠后，BALB/C小鼠和 BALB/C-nu小鼠，肺組織病變較重，肺泡間隔明顯增寬，血管擴(kuò)張充血，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，肺泡縮小變形；NODScid小鼠、Scid小鼠、NOD/LTJ小鼠和 icosl-KO小鼠，肺組織病變較輕，肺泡間隔明顯增寬，血管擴(kuò)張充血，間質(zhì)少量炎細(xì)胞浸潤。6只小鼠肺組織小血管內(nèi)見血栓形成（圖1C、D）（血栓形成的小鼠數(shù)和取材小鼠數(shù)見表2）。其他臟器未見異常改變。

PTAH改良染色顯示觀察到的血栓中有纖維蛋白，P選擇素的免疫組織化學(xué)染色血栓顯色為陽性，即血栓中有活化聚集的血小板（圖1E、F）（圖1見文后插1）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中使甲型流感病毒H1N1和H3N2感染小鼠，其中H1N1毒力較強(qiáng)，動物死亡率較高，H3N2毒力較溫和，沒有動物死亡。兩種病毒感染小鼠后取小鼠肺組織提取RNA進(jìn)行PCR檢測，均得到一定數(shù)量的病毒RNA拷貝，不同組別在數(shù)量上有所差異，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。感染小鼠均觀察到肺組織病理改變，并在多只動物的肺組織內(nèi)觀察到血栓形成，多位于直徑20～60μm的小血管內(nèi)，最大的見于平均直徑90μm血管內(nèi)。根據(jù)特殊染色和免疫組織化學(xué)的結(jié)果血栓成分主要是纖維素和血小板。所以從成分和形成位置來看與PE體循環(huán)來源的混合血栓栓子經(jīng)肺循環(huán)進(jìn)入肺動脈不同，我們觀察到的血栓可能是在肺小血管中原位形成的。另外，不管是H1N1還是H3N2感染小鼠，感染早期在小靜脈和毛細(xì)血管中出現(xiàn)血栓的可能性相對較大，也可能是由于隨著時(shí)間延長早期形成的血栓又有部分溶解。這與一項(xiàng)針對2 258名泌尿系統(tǒng)感染和3 375名呼吸道感染的研究顯示的結(jié)果相一致，感染患者的DVT和PE的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著上升，并在最初的兩周達(dá)到高峰，在隨后的數(shù)月中患病風(fēng)險(xiǎn)逐漸降低，至一年以后降至基線水平［3］。

實(shí)驗(yàn)中用到的不同品系的小鼠，其免疫系統(tǒng)狀態(tài)各有不同：Scid小鼠存在T、B細(xì)胞缺陷；NOD/LtJ小鼠存在NK細(xì)胞缺陷，也因發(fā)生自身免疫常用于1型糖尿病的研究；NOD-Scid小鼠存在T、B、NK細(xì)胞缺陷；BALB/C-Nu小鼠存在 T細(xì)胞缺陷；Icosl-KO小鼠則有T輔助細(xì)胞異常分化，脾臟生發(fā)中心數(shù)量減少、體積縮小，T、B細(xì)胞相互作用異常；BALB/C小鼠作為對照小鼠，其沒有免疫細(xì)胞種類的缺陷，于6月齡以后可能出現(xiàn)免疫球蛋白增多。不同病毒感染小鼠后，在不同品系小鼠均觀察到有血栓的形成。H1N1和H3N2感染小鼠后各品系小鼠血栓出現(xiàn)情況并不完全一致，其中BALB/c小鼠、NOD/LtJ小鼠和NOD-Scid小鼠都觀察到血栓的形成，形成比例在兩種病毒的感染中略有差異；Scid小鼠僅在H3N2感染后觀察到血栓形成，而BALB/c-Nu小鼠和icosl-KO小鼠僅在 H1N1感染后觀察到血栓形成，可能與病毒毒力和感染特性有關(guān)。比較各品系小鼠血栓形成結(jié)果，NK細(xì)胞可能在血栓形成過程中的作用不大，T細(xì)胞的部分功能，或T細(xì)胞與其他免疫成分的相互作用在血栓形成過程中發(fā)揮一定作用，但由于樣本量較少，影響品系間差異的觀察，產(chǎn)生一定的偏差，且免疫系統(tǒng)內(nèi)的各種成分間相互作用復(fù)雜，故對免疫成分參與血栓形成的機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

已有研究發(fā)現(xiàn)流感引起的炎癥反應(yīng)能夠?qū)е卵ㄕ{(diào)節(jié)素水平的下調(diào)，抗凝血激活蛋白C水平下降，纖溶酶原激活物抑制劑（plasm inogen activator inhibitor-l，PAI-1）水平升高，從而導(dǎo)致纖維帶白溶解作用下降；且炎癥本身能夠誘導(dǎo)血小板數(shù)量的升高［4］。也曾有尸檢發(fā)現(xiàn)感染 A型 H1N1流感病毒的患者肺周圍小血管內(nèi)見到小血栓形成［5］。也有報(bào)道人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染急性期與血栓形成有關(guān)，而且抗病毒藥物的使用能夠抑制HCMV感染引起的血小板的粘附和聚集活性增強(qiáng)；體外HCMV感染人包皮成纖維細(xì)胞可使血管假性血友病因子（von W illebrand factor， vWF）、細(xì)胞間粘附分子 （intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細(xì)胞粘附分子（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達(dá)水平增高，從而促進(jìn)血栓形成［6］。一項(xiàng)對1986年至2004年十多年間發(fā)表的文獻(xiàn)的總結(jié)性研究發(fā)現(xiàn) HIV感染增加了患者的血液凝固性和血管內(nèi)皮的活化，同時(shí)臨床也觀察到病毒感染還可能引起病人肺動脈壓的改變，從而造成HIV感染者血栓性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高［7］。所以病毒感染對靜脈血栓形成有一定的影響，且某些病毒感染本身即可導(dǎo)致血管內(nèi)皮的損傷和活化，也與病毒感染后可能引發(fā)其他的感染和自身免疫反應(yīng)有一定的關(guān)系。

PE具有多種臨床表現(xiàn)譜，發(fā)病的危險(xiǎn)因素也多種多樣，根據(jù) Rudolf Virchow提出的經(jīng)典的血栓形成三要素學(xué)說，將外科術(shù)后，創(chuàng)傷，長途飛行造成的制動作用、妊娠狀態(tài)、肥胖、高齡、惡性腫瘤和口服避孕藥等都成為PE的危險(xiǎn)因素。但臨床上以此為依據(jù)制定的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分級和預(yù)防性治療對PE的發(fā)病率和病死率的控制效果不明顯，且臨床上確也觀察到有些患者VTE的發(fā)生找不到易辨認(rèn)的危險(xiǎn)因素。隨著環(huán)境的改變和人口流動性的增加，病毒感染在人群中越來越普遍，一些毒力并不強(qiáng)的病毒感染發(fā)病隱匿，很容易被臨床忽視，但卻在很大程度上影響了人體的免疫狀態(tài)，引起內(nèi)環(huán)境的改變，導(dǎo)致各種免疫細(xì)胞和免疫分子的平衡被打破，病毒本身復(fù)制也引起血管內(nèi)皮損傷等組織學(xué)改變，最終導(dǎo)致凝血系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng)的功能紊亂，從而促使血栓形成。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一定程度上支持病毒感染可作為血栓形成危險(xiǎn)因素的觀點(diǎn)，但由于實(shí)驗(yàn)對象小鼠與人類循環(huán)系統(tǒng)有很大區(qū)別，我們對小鼠的凝血系統(tǒng)的組成和運(yùn)作了解也還不多，所以要在動物身上復(fù)制真正病因?qū)W上的VTE模型，并驗(yàn)證其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的探索。

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