不同能量的培養(yǎng)條件對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞生長的影響

趙靜姝，王 蓉，張景燕，吳燕川，姬志娟

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，老年病醫(yī)療研究中心，神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

熱量限制(caloric restriction，CR)是指一種有計(jì)劃的減少由食物提供的熱量的進(jìn)食方式，一般是指在生物體所攝入營養(yǎng)成分保證其不發(fā)生營養(yǎng)不良的情況下，將正常自由進(jìn)食(ad libitum，AL)所得熱量減去30%～50%。最早由McCay等人于上世紀(jì)30年代提出，并發(fā)現(xiàn)這種進(jìn)食方式可以延長小鼠的平均壽命和最長壽命［1］。

CR的研究多集中在各種動(dòng)物模型中，CR可以降低體重，下調(diào)血壓，降低空腹血糖、胰島素和膽固醇水平，維持年輕的生理狀態(tài)［2］。對(duì)恒河獼猴進(jìn)行長達(dá)20多年的CR研究發(fā)現(xiàn)，CR可降低恒河獼猴糖尿病、癌癥、心血管疾病和腦萎縮等多種年齡相關(guān)性疾病的發(fā)生并延緩衰老［3］，并對(duì)很多年齡相關(guān)的如紋狀體體積下降，運(yùn)動(dòng)功能遲緩，機(jī)體免疫系統(tǒng)下降等都有改善作用［4］。

目前對(duì)于熱量限制的體外細(xì)胞模型的研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)旨在通過降低培養(yǎng)液中細(xì)胞的主要能量消耗來源葡萄糖的方式建立SH-SY5Y細(xì)胞熱量限制模型，進(jìn)一步探討CR對(duì)細(xì)胞生長的影響，并為下一步探討CR對(duì)人體各種作用的作用機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)，提供良好的體外模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞來自瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院。

1.1.2 試劑：噻唑蘭 (MTT)購自Sigma公司，二甲基亞砜(DMSO)購自北京亞太精細(xì)化工公司，乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒購自北京化工廠，編號(hào)001012。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：正常對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)條件為DMEM ×F12(Gibco)培養(yǎng)基中加入10% 胎牛血清、青霉素100IU/m L、鏈霉素100IU/m L于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6天傳代1次，中間換液1次。高糖組與低糖組培養(yǎng)基分別為DMEM(4.5g/L L-glucose)和DMEM(2.0g/L L-glucose)加10%胎牛血清，余與正常對(duì)照組相同。

1.2.2 MTT代謝率測定：將SH-SY5Y細(xì)胞以2× 103/m L接種于96孔板(Costar產(chǎn)品)，分為以上三組，每組12孔，培養(yǎng)3d后統(tǒng)一換成DMEM ×F12無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后做MTT代謝率測定，每孔加MTT(5mg/m L)20μL，37℃孵育4h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200μL，振搖10min，用全波長酶標(biāo)儀(Multiskan Spectrum)測定550nm處光密度值(A)。

1.2.3 細(xì)胞生長形態(tài)觀察及細(xì)胞計(jì)數(shù)：將 SHSY5Y細(xì)胞以2×102/m L接種于6孔板(Costar產(chǎn)品)，分為以上3組，每組8孔，自接種后第3、5、7、9、11、13、15、16天時(shí)，用倒置顯微鏡(Olympus產(chǎn)品)觀察細(xì)胞形態(tài)，并采用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4 LDH漏出率測定：將細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中各孔細(xì)胞培養(yǎng)液收集，按照 LDH測定試劑盒所示方法(比色法)，測定550nm處光密度值，同時(shí)做LDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計(jì)分析，資料數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異顯著性檢驗(yàn)用單因素方差分析(One Way ANOV)及重復(fù)資料的方差分析。P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性意義，P＜0.01認(rèn)為差異有非常顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT代謝率測定

結(jié)果顯示高糖組A值為0.573±0.001，低于對(duì)照組(0.742±0.003)，降低幅度為22.78%，兩組相比P＜0.01；低糖組 A值為0.428±0.003，低于對(duì)照組，降低幅度為 42.32%，兩組相比 P＜0.01。(圖1)

2.2 細(xì)胞生長曲線

細(xì)胞生長曲線如圖2所示，在生長初期，各組細(xì)胞均隨生長天數(shù)延長，數(shù)目顯著增多，到第11天左右，各組細(xì)胞達(dá)到生長頂峰，隨后各組細(xì)胞以不同速度死亡。其中與對(duì)照組相比，高糖組細(xì)胞生長略慢，當(dāng)達(dá)到頂峰后，細(xì)胞死亡明顯，細(xì)胞數(shù)目下降幅度較大。而低糖度細(xì)胞總體生長過程緩慢，在達(dá)到頂峰以后，細(xì)胞死亡不太明顯，而且在實(shí)驗(yàn)觀察終點(diǎn)，低糖組細(xì)胞數(shù)目高于對(duì)照組和高糖組，說明低糖生長環(huán)境下細(xì)胞生長慢，代謝速度低，對(duì)衰老的細(xì)胞起到了一定的保護(hù)作用，降低細(xì)胞的死亡速度。

圖1 不同能量對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生長代謝率的影響Fig.1 Effect of different energy supplies on the metabolic rate of SH-SY5Ycells注：與對(duì)照組相比，＊＊P＜0.01Note：＊＊P＜0.01，compared with the control group

圖2 不同能量組細(xì)胞生長曲線Fig.2 The cell growth curves of different groups

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

圖3所示為各組細(xì)胞在不同生長階段時(shí)的細(xì)胞形態(tài)。圖3.1所示為生長初期第3天的細(xì)胞形態(tài)，各組細(xì)胞數(shù)目尚少，細(xì)胞在6孔板中分布集中，成簇生長，低糖組細(xì)胞數(shù)目明顯較其他兩組少。圖3.2所示為生長中期第11天的細(xì)胞形態(tài)，各組細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)，數(shù)目達(dá)到頂峰，細(xì)胞生長良好，尤其是低糖組的細(xì)胞突起伸展良好細(xì)長，而高糖組細(xì)胞的突起則相對(duì)縮短，不明顯。圖3.3所示為生長末期第16天時(shí)細(xì)胞形態(tài)，各組細(xì)胞之間差異比較明顯，高糖組細(xì)胞死亡顯著，視野中僅殘存少量活細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞死亡相對(duì)較少，但是細(xì)胞已經(jīng)有皺縮，突起結(jié)構(gòu)消失，失去活性，臺(tái)盼藍(lán)染色時(shí)著色較深，低糖組細(xì)胞較對(duì)照組和高糖組細(xì)胞死亡數(shù)目少，活性好(圖3見文后彩插3)。

2.4 LDH漏出率測定結(jié)果

圖4所示為各組細(xì)胞在不同生長階段的LDH漏出率測定結(jié)果。高糖組的LDH漏出率始終較其他兩組高，說明高糖組代謝快，而且在生長階段的初期，高糖組與對(duì)照組相比，LDH漏出率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在生長階段后期高糖組和正常組細(xì)胞較低糖組受損明顯，代謝產(chǎn)生的廢物等致使細(xì)胞生長環(huán)境變差，不利于細(xì)胞生長，從而使細(xì)胞大量死亡，LDH漏出顯著，而低糖組細(xì)胞則因代謝緩慢，整個(gè)生長環(huán)境相對(duì)平衡，從而細(xì)胞在生長后期仍能保持良好的生長狀態(tài)，LDH漏出率與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且LDH漏出率的結(jié)果與生長曲線相結(jié)合來看結(jié)果是一致的。

圖4 不同能量組LDH漏出率的測定結(jié)果Note：＊＊P＜0.01，the high glucose group compared with the control group；★★P＜0.01，the low glucose group compared with the control group.Fig.4 The cell LDH leakage rates in different groups

3 討論

熱量限制(30% ～50%)這種對(duì)機(jī)體的干預(yù)方式的有利作用已經(jīng)在各種生理和病理動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證，作用廣泛，涉及到延緩衰老、對(duì)抗各種老年性疾病，使機(jī)體保持年輕生理狀態(tài)等。其中熱量限制對(duì)于改善動(dòng)物認(rèn)知功能，預(yù)防和改善神經(jīng)退行性疾病的作用也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。SH-SY5Y細(xì)胞來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤，其細(xì)胞形態(tài)及生理、生化功能與正常神經(jīng)元相似，已廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)的研究。本實(shí)驗(yàn)遵循熱量限制的定義，將在體適度熱量限制轉(zhuǎn)換成降低細(xì)胞體外培養(yǎng)條件中葡萄糖的濃度，將一般體外培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y葡萄糖濃度從 3.15g/L下降到 2g/L (36%熱量限制)，觀察這樣的條件對(duì)細(xì)胞基本生長情況的影響，并采用高糖培養(yǎng)條件作為陽性對(duì)照，應(yīng)用MTT代謝率測定，細(xì)胞生長曲線及LDH漏出率測定等基本指標(biāo)對(duì)這一體外模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)觀察到低糖培養(yǎng)條件下MTT代謝率測定結(jié)果低，細(xì)胞代謝緩慢，在整個(gè)生長周期中，細(xì)胞生長緩慢，生長環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，該組細(xì)胞保持了較恒定的細(xì)胞生長能力和修復(fù)能力，雖然早期細(xì)胞生長較慢，但是其保持了一定的增殖潛力，在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谙鄬?duì)于其他兩組死亡不明顯，LDH漏出率偏低，殘存有活性的細(xì)胞數(shù)較多，細(xì)胞形態(tài)仍較年輕，如突起伸展良好。我們得到的結(jié)論是低糖培養(yǎng)條件不但不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，反而起到一定程度的保護(hù)作用，延緩細(xì)胞進(jìn)入衰老階段的進(jìn)程，讓細(xì)胞處在有活力的生長階段。這一結(jié)論與CR在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的研究結(jié)論相一致［6］，CR可以使機(jī)體延緩衰老，可能就是CR使細(xì)胞保持了年輕的生理狀態(tài)，從而使得整個(gè)機(jī)體處于協(xié)調(diào)狀態(tài)，更有效的延長壽命，延緩衰老。

在上述低糖培養(yǎng)條件對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y降低代謝，保護(hù)其生長能力的同時(shí)，作為陽性對(duì)照的高糖培養(yǎng)條件顯示了一系列相反的作用，高糖培養(yǎng)條件可以導(dǎo)致細(xì)胞衰老加快，LDH漏出率增加，死亡加速，和既往報(bào)道結(jié)果一致［7］。

熱量限制對(duì)機(jī)體的各種作用機(jī)制已經(jīng)被人們研究了70多年，仍然未完全得以闡述，本實(shí)驗(yàn)通過建立人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y熱量限制模型，可在相對(duì)簡單可控條件下進(jìn)行生長、代謝以及深入分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的一系列細(xì)胞和分子水平的研究，為熱量限制對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究提供了基礎(chǔ)支持。

［1］McCay CM，Crowell MF，Maynard LA.The effect of retarded growth upon the length of life and upon ultimate size.1935［J］.Nutrition，1989，5(3)：155-171.

［2］Ding Q，Ash C，M racek T，et al.Caloric restriction increases adiponectin expression by adipose tissue and prevents the inhibitory effect of insulin on circulating adiponectin in rats［J］.J Nutr Biochem，2011，［Epub ahead of print］.

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［4］Matochik JA，Chefer SI，Lane MA，et al.Age-related decline in striatal volume in rhesus monkeys：assessment of long-term calorie restriction［J］.Neurobiol Aging，2004，25(2)：193-200.

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