半支蓮主要化學(xué)成分的HPLC-TOF/MS分析

紀(jì)松崗，劉 悅，毛 飛，李 祥，柴逸峰(.解放軍第40醫(yī)院藥劑科，山東青島6607;.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海004;.北京兒童醫(yī)院藥劑科，北京00056)

半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，是我國傳統(tǒng)的中藥，其名最早見于《外科正宗》，主要產(chǎn)于浙江、江蘇、安徽、河南、四川、廣東、福建、陜西等省［1］。其味辛、苦，性寒，具有清熱解毒、化瘀利尿、活血祛疲、消腫止痛之功效，用于治療瘡癰腫毒、蛇蟲咬傷、痢疾、肝炎及肝硬化等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，半枝蓮的水提物與醇提物均有明顯的抗腫瘤活性［2，3］，常用于肝癌、肺癌及胃癌等癌癥的防治［4］。

中外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)半枝蓮的主要化學(xué)成分為生物堿、黃酮類、多糖、有機(jī)酸、甾醇等［5］。目前對(duì)半枝蓮中化學(xué)成分分析主要是采用傳統(tǒng)的植物化學(xué)的方法進(jìn)行分離提?。?，7］，部分研究采用高效液相色譜法進(jìn)行分析［8］，這些方法一般分析時(shí)間較長，而且僅針對(duì)其中某幾種或某一類物質(zhì)進(jìn)行分析，而缺乏從整體上系統(tǒng)地闡述半枝蓮的復(fù)雜化學(xué)成分。

本研究采用HPLC-TOF/MS技術(shù)對(duì)半枝蓮中多成分進(jìn)行了鑒別，該法操作簡便、快速、準(zhǔn)確，對(duì)闡明半枝蓮藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制、開發(fā)現(xiàn)代中藥新藥等具有重要意義。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent 1200系列快速液相色譜儀，配有在線脫氣機(jī)、二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器;Agilent 6220高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源(ESI)，分析軟件為MassHunter在線工作站和Qualiative Analysis離線分析軟件DJ-04藥材粉碎機(jī)(上海淀久公司);Mettler AE240型十萬分之一電子天平;Kudos-SK2200H超聲發(fā)生器(上?？茖?dǎo)超聲儀器公司)。

1.2 試藥 半枝蓮草藥材由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室孫連娜副教授鑒定為唇形科黃芩屬植物半枝蓮Scutellaria barbata D.Don。HPLC級(jí)乙腈(Merck，Germany);HPLC級(jí)甲酸(Tedia，USA);無水乙醇為分析醇(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司);水為娃哈哈純凈水。

2 試驗(yàn)

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱:SHISEIDO CAPCELL PAK C18(100 mm×3.0 mm，3 μm)，流動(dòng)相A相為乙腈，B相為水(含0.1%甲酸)，梯度洗脫，A相比例隨時(shí)間的變化:25%(1～5 min);25%～55%(5～12 min);進(jìn)樣量:3 μl;流速:0.6 ml/min;柱溫25℃;運(yùn)行時(shí)間30 min;柱后分流比為3∶1。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用ESI源，正離子模式，霧化氣為高純氮?dú)?。具體質(zhì)譜參數(shù):毛細(xì)管電壓4 000 V，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速9 L/min，霧化氣壓力35 psi(1 psi=6 894.8 Pa)，碎片電壓180 V;參比離子m/z 121.050 8和m/z 922.009 7;質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z 100～1 000測定樣品之前，使用調(diào)諧液校準(zhǔn)質(zhì)量軸，以保證質(zhì)量精度誤差小于1×10－6。

2.2 供試品溶液制備 取半枝蓮藥材適量，粉碎后過40目篩，稱取半支蓮藥材1.0 g，置100 ml量瓶中，加70%乙醇20 ml，稱重，超聲30 min(超聲功率為500 W，頻率40 kHz)，冷卻后補(bǔ)足失重。取5 ml醇提液，10 800 r/min離心5 min，取上清，再用微孔濾膜過濾(0.45 μm)過濾，作為供試品溶液。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。

2.3 半枝蓮化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立 根據(jù)國外專業(yè)數(shù)據(jù)庫Pubmed Chem Spider、中國科學(xué)院化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫等及國內(nèi)外相關(guān)研究文獻(xiàn)，收集了半枝蓮各種化學(xué)成分名稱及分子式共87個(gè)，采用安捷倫formula-database generator軟件(含各元素精確質(zhì)量數(shù))，計(jì)算精確相對(duì)分子質(zhì)量，建立了包括化合物名稱、分子式、精確相對(duì)分子質(zhì)量M+H準(zhǔn)分子離子峰相對(duì)分子質(zhì)量的相應(yīng)的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取溶劑的選擇 首先考察了提取方法，本試驗(yàn)選擇了較為簡便的溶劑超聲法。對(duì)于提取溶劑，由于半枝蓮主要成分為黃酮類，根據(jù)其成分特點(diǎn)，考察了甲醇以及70%乙醇，發(fā)現(xiàn)采用70%的乙醇提取獲得的峰容量最大，故采用70%乙醇超聲為提取方法。

3.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化 考察了甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈的洗脫效果優(yōu)于甲醇，且各色譜峰分離效果更好，加入0.1%甲酸可以改善峰拖尾，并提高質(zhì)譜響應(yīng)，故采用乙腈-水(0.1%甲酸)為流動(dòng)相。質(zhì)譜檢測比較了正、負(fù)離子兩種掃描模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正模式下峰容量大，質(zhì)譜響應(yīng)更好，故實(shí)驗(yàn)最終選擇在正模式下進(jìn)行。

3.3 半枝蓮中主要化學(xué)成分的鑒別 在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下，半枝蓮提取液的HPLC-TOF/MS典型總離子流圖見圖1。我們對(duì)其中主要的15個(gè)峰進(jìn)行了鑒別，其中包括4對(duì)同分異構(gòu)體。其中，峰2和4這一對(duì)同分異構(gòu)體，兩者質(zhì)譜裂解所得碎片離子相同，故通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖，判定峰2為紅花素葡萄糖醛酸苷，峰4為異紅花素葡萄糖醛酸苷。其它化合物按照以下方法鑒別:首先，根據(jù)TOF-MS上所得到的精確化合物分子量信息，通過Mass Hunter軟件在5 ppm的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)計(jì)算其可能的元素組成，并將其與所建的數(shù)據(jù)庫相匹配，對(duì)半枝蓮化學(xué)成分的初步鑒別，結(jié)果見表1。然后對(duì)同分異構(gòu)體進(jìn)行鑒別，調(diào)節(jié)碎片電壓至360 V，獲得化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)的碎片離子，根據(jù)離子的裂解情況，結(jié)合數(shù)據(jù)庫中各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，區(qū)分各同分異構(gòu)體，結(jié)果見表2。最終確證了其中的15個(gè)峰，結(jié)果見表1。

圖1 半枝蓮提取物TOF/MS總離子流圖

以分子離子峰287為例，來說明鑒別過程。在碎片電壓160 V條件下，峰9和峰10的分子離子峰均為287。首先確定峰9和峰10精確的分子離子峰分別為287.055 8與287.056 0，可推斷峰9和峰10的元素組成均為C15H10O6，通過與數(shù)據(jù)庫匹配，初步可判定其為一對(duì)同分異構(gòu)體，Scutellarein和Luteolin。為進(jìn)一步區(qū)分這對(duì)同分異構(gòu)體，調(diào)節(jié)碎片電壓至360 V，得到此電壓條件下的質(zhì)譜圖。峰9的質(zhì)譜圖上有明顯的169.013 7［M+H-C8H6O］+，123.008 2［M +H-C8H6O-CO-H2O］+，119.049 7［M+H-C7H4O5］+等碎片離子信息，推斷出裂解途徑見圖2(a)所示。峰10的質(zhì)譜圖上有明顯的153.018 8［M+HC8H6O2］+，135.044 6［M+H-C7H4O4］+，161.023 9［M+H-C6H6O3］+等碎片信息，推斷出裂解途徑見圖2(b)所示。結(jié)合以上信息，我們能夠鑒定峰9為Scutellarein，峰10為Luteolin。采用類似的方法，能夠?qū)ζ渌逡策M(jìn)行相應(yīng)的鑒別。

表2 半枝蓮成分中的同分異構(gòu)體鑒別結(jié)果

圖2 Scutellarein和Luteolin ESI+MS裂解途徑

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-TOF/MS技術(shù)，結(jié)合數(shù)據(jù)庫匹配，實(shí)現(xiàn)了對(duì)半支蓮中主要成分的快速定性分析，共鑒定出15個(gè)半支蓮中的主要糖苷類和黃酮類成分。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確度高，可作為半支蓮質(zhì)量控制的方法之一，同時(shí)為半支蓮的藥理學(xué)和臨床藥學(xué)研究提供了化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)信息。

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