石油醚浸出-皂化凈化-高效液相色譜法測(cè)定油茶籽中的苯并（α）芘的研究

莫潤(rùn)宏，湯富彬，丁 明，屈明華，倪張林，沈丹玉，鐘冬蓮

（中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)局經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江 富陽(yáng) 311400）

苯并（α）芘屬多環(huán)芳烴類(lèi)物質(zhì)，由5個(gè)苯環(huán)構(gòu)成，具有強(qiáng)致癌作用，且其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，易積累，有較大的潛在危害。苯并（α）芘廣泛存在于肉類(lèi)食品、熏烤食品和食用油中，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2762-2005和GB2716-2005中規(guī)定了熏烤肉和糧食中的苯并（α）芘的限量為5 μg/kg，食用油中的苯并（α）芘的限量為10 μg/kg[1-2]。油茶籽油以其豐富的不飽和脂肪酸、維生素E和微量礦質(zhì)元素等受到人們青睞[3]，但油茶籽油苯并（α）芘超標(biāo)事件給我國(guó)茶油市場(chǎng)和產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了不小的影響。目前，對(duì)于油茶籽油加工技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)及安全指標(biāo)的研究較多[4-7]，但對(duì)作為原料的油茶籽關(guān)注薄弱。炒制后的油茶籽能提高初榨時(shí)的出油率，但炒制時(shí)的高溫?zé)o疑引入了產(chǎn)生苯并（α）芘的潛在風(fēng)險(xiǎn)[8]，而苯并（α）芘良好的脂溶性將使其比較容易從油茶籽轉(zhuǎn)移到油茶籽油中，直接影響油茶籽油食用安全。

據(jù)報(bào)道，有關(guān)苯并（α）芘的檢測(cè)方法主要有：比色法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法等[9-12]，凈化方法主要由GPC法、中心氧化鋁SPE凈化法等[13-14]。油茶籽樣品不同于一般低脂樣品（如一般肉類(lèi)樣品、蔬菜樣品），基質(zhì)簡(jiǎn)單；也不同于食用油脂樣品，以均一穩(wěn)定的液體形式存在，性質(zhì)穩(wěn)定。油茶籽樣品含油量高，還含有色素等其他物質(zhì)，基質(zhì)復(fù)雜，這給樣品前處理及檢測(cè)帶來(lái)很大難度。本文提出了一種石油醚浸出-皂化凈化-高效液相色譜法測(cè)定油茶籽中苯并（α）芘的方法，該法重現(xiàn)性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters2695液相色譜儀配熒光檢測(cè)器（美國(guó)waters公司），萬(wàn)分位分析天平（梅特勒，上海），恒溫水浴鍋（科導(dǎo)，上海），超聲清洗器（科導(dǎo)，上海），超純水儀（Milli-Q，美國(guó)），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi，瑞士），均質(zhì)器（IKA，德國(guó)）。

石油醚（沸程60～90℃），無(wú)水硫酸鈉，氯化鈉，氫氧化鉀，無(wú)水乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙腈（色譜純，TEDAI，美國(guó)）。

苯并（α）芘（甲醇）標(biāo)準(zhǔn)品：20 μg/mL（國(guó)家標(biāo)物中心）。

1.2 前處理方法

1.2.1 提 取 稱(chēng)取粉碎后的油茶籽試樣25.00 g（精確至0.01 g）于250 mL磨口平底燒瓶中，加100 mL石油醚，用均質(zhì)器均質(zhì)2 min后，超聲提取30 min，取出，裝上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（45℃）揮發(fā)至干。

1.2.2 凈 化 在提取完的磨口平底燒瓶中加入100 mL 2 mol/L氫氧化鉀乙醇溶液，85℃水浴冷凝回流皂化1 h，取出冷卻。將皂化液通過(guò)塞有棉花的漏斗，轉(zhuǎn)移至500 mL分液漏斗，加50 mL飽和氯化鈉溶液，加石油醚，萃取 3 次（50、50、30 mL）。合并萃取液于250 mL分液漏斗中，用超純水洗至中性。將石油醚相通過(guò)無(wú)水硫酸鈉濾入250 mL磨口平底燒瓶中，在50℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入2 mL乙腈清洗燒瓶?jī)?nèi)壁，復(fù)溶苯并（α）芘，過(guò)0.22 μm有機(jī)相膜待測(cè)。

1.3 色譜及檢測(cè)器條件

色譜柱：多環(huán)芳烴（PAH）C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm柱）；流動(dòng)相：乙腈∶0.5%磷酸溶液（V/V，95∶5）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL[15]。熒光檢測(cè)器條件：激發(fā)波長(zhǎng)384 nm，發(fā)射波長(zhǎng)406 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件選擇

提取時(shí)選擇石油醚為提取劑，利用苯并（α）芘較強(qiáng)的脂溶性，將其從油茶籽中提出。油茶籽中的油脂也會(huì)隨即提出，有利于下步皂化。傳統(tǒng)提取方法主要通過(guò)索氏抽提法，提取時(shí)間一般為4～12 h，耗時(shí)較長(zhǎng)。采用均質(zhì)后，超聲輔助提取，能大大縮短提取時(shí)間，提取效果良好[16-17]。

2.2 凈化條件選擇

凈化油脂方法多采用GPC凈化和中性氧化鋁SPE柱凈化，但GPC凈化所用儀器昂貴，中性氧化鋁SPE柱在油脂含量較高時(shí)凈化作用不明顯。利用苯并（α）芘不溶于水且對(duì)酸堿穩(wěn)定的性質(zhì)，采用氫氧化鉀乙醇溶液皂化的方法，除去油脂，達(dá)到凈化目的。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 方法的定量下限（LOQ） 在空白樣品中，添加低濃度的標(biāo)樣，按照峰面積信噪比大于10（S/N＞10）進(jìn)行計(jì)算，得到苯并（α）芘的定量下限為0.1 μg/kg，滿足國(guó)標(biāo)檢測(cè)限量要求。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 準(zhǔn)確吸取苯并（α）芘（甲醇）標(biāo)樣1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到2000 μg/mL苯并（α）芘母液。吸取母液0.5 mL于10 mL容量瓶中，氮?dú)獯蹈?，用乙腈溶解定容，?00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL于10 mL容量瓶，用乙腈定容，得1.0、2.0、5.0、10、20 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)使用液。依次從低濃度到高濃度進(jìn)樣20 μL，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在1.0～20 μg/mL內(nèi)線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=112 391 x+48 692，R2=0.999。

2.3.3 方法精密度和回收率 在空白樣品中，分別加入不同濃度的苯并（α）芘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按建立的提取凈化方法操作并檢測(cè)，選擇苯并（α）芘1.0、10、20 μg/kg 3個(gè)添加水平，計(jì)算苯并（α）芘平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6），見(jiàn)表 1。結(jié)果表明，在 1.0、10、20 μg/kg 3個(gè)添加水平時(shí)，苯并（α）芘的平均回收率為84.0%～94.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.29%～8.26%間，準(zhǔn)確度和精密度均達(dá)到殘留分析的要求。

表1 苯并（a）芘添加回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3.4 實(shí)際樣品測(cè)試 對(duì)實(shí)際炒焦的10批油茶籽樣品進(jìn)行檢測(cè)，2批炒焦油茶籽樣品中檢出含有苯并（α）芘，含量分別為 0.32、0.64 μg/kg。標(biāo)樣及樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 苯并（α）芘標(biāo)樣及油茶籽樣品檢測(cè)色譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了一種石油醚浸出-皂化凈化-高效液相色譜法測(cè)定油茶籽中苯并（α）芘含量的檢測(cè)方法。方法相對(duì)偏差為4.29%～8.26%，加標(biāo)平均回收率為84.0%～94.0%，結(jié)果表明該方法精密度好，準(zhǔn)確性高，檢測(cè)所用試劑成本低，操作簡(jiǎn)單，完全適用于油茶籽中苯并（α）芘的測(cè)定。

[1]GB 2762-2005.食品中污染物限量[S].

[2]GB 2716-2005.食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

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