丹梔逍遙散對(duì)D-氨基半乳糖所致大鼠急性肝損傷保護(hù)作用的研究

曾曉艷 ，廖亮英 ，姜 帆 ，譚朝陽 ，楊先國(guó) ，陳貴海 *

（1.廣西中醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

丹梔逍遙散對(duì)D-氨基半乳糖所致大鼠急性肝損傷保護(hù)作用的研究

曾曉艷1，廖亮英2，姜 帆2，譚朝陽3，楊先國(guó)3，陳貴海2*

（1.廣西中醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的 探討丹梔逍遙散對(duì)D-氨基半乳糖（D-GaIN）所致大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法 將60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，聯(lián)苯雙酯組，丹梔逍遙散高、中、低劑量組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥7 d后，除空白組腹腔注射等體積生理鹽水外，其余大鼠均腹腔注射D-GaIN。24 h后，檢測(cè)血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、肝勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）的含量。結(jié)果 丹梔逍遙散能明顯抑制由D-GaIN所致的血清中ALT、AST以及肝勻漿中MDA含量的升高，并提高肝勻漿中SOD和GSH-PX的含量，其中大部分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 丹梔逍遙散對(duì)D-GaIN所致的大鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用。

丹梔逍遙散；急性肝損傷；D-氨基半乳糖；大鼠；牡丹皮；梔子；當(dāng)歸

肝損傷是由各種肝臟疾病所產(chǎn)生的病變結(jié)果。臨床上造成急性肝損傷的原因主要有病毒感染、服用藥物不當(dāng)、食物添加劑、乙醇攝入過量、誤服有毒食物、放射線損傷等，其長(zhǎng)期存在往往是導(dǎo)致肝纖維化，甚至肝硬化、肝癌發(fā)生的重要因素。近年來，對(duì)急性肝損傷的防治已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者紛紛研究的一個(gè)重要課題。丹梔逍遙散出自薛己的《內(nèi)科摘要》，又名八味逍遙散、加味逍遙散，是在逍遙散基礎(chǔ)上加牡丹皮、梔子組成，具有疏肝健脾、清熱活血的功效，適用于肝郁血虛生熱諸癥。本方廣泛運(yùn)用于臨床各科疾病，在保肝護(hù)肝方面已被證實(shí)有較好的療效[1]。本實(shí)驗(yàn)通過建立動(dòng)物模型，對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～200 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)有限公司提供，室溫18～20℃，濕度為65%～70%，合格證號(hào)：2008001606577。

1.1.2 藥物 丹梔逍遙散由牡丹皮、梔子、當(dāng)歸、芍藥等8味中藥組成，中藥飲片購自湖南老百姓大藥房，煎成湯劑，濃縮備用，其生藥濃度為2 g/mL。聯(lián)苯雙酯滴丸（1.5 mg/粒，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號(hào)：090604），試驗(yàn)前用蒸餾水配成所需濃度，供動(dòng)物灌胃用。

1.1.3 試劑 D-氨基半乳糖，美國(guó)sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)：70M1194V。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為：100741.201010、101521.201011。丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽-過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，批號(hào)分別為：20101206、20101129、20101222。

1.1.4 儀器 AF-100制冰機(jī)，意大利斯科茨曼（Scotsman）公司；Allegra 25R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫爾特公司；AY-120電子分析天平，日本島津；DJ-10002電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；XHF-D高速分散器（內(nèi)切式勻漿機(jī)），寧波新芝生物科技股份有限公司；RT-1904C型半自動(dòng)生化分析儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)，日本島津。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 將D-氨基半乳糖（D-GaIN）用無菌生理鹽水配成10%的溶液，并用1 mmol/LNaOH將pH值調(diào)至7.0，末次給藥后1h，將模型組、各給藥組大鼠腹腔內(nèi)一次性注射D-GaIN（預(yù)實(shí)驗(yàn)確定劑量為800 mg/kg），制備急性肝損傷大鼠模型。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組、丹梔逍遙散高、中、低劑量組，每組10只大鼠。給藥劑量均按60 kg成人體表面積換算，聯(lián)苯雙酯滴丸日給藥量為13.5 mg/kg，丹梔逍遙散高、中、低劑量組日給藥量為15.33、7.66、3.83 g/kg，大鼠灌藥體積為10 mL/kg，空白組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃，所有大鼠連續(xù)灌胃7 d，1次/d，末次給藥后1 h，模型組和各給藥組大鼠按0.8 g/kg腹腔注射D-GaIN，空白組腹腔注射等體積生理鹽水，24 h后，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉，麻醉后腹主動(dòng)脈取血，離心，取血清備檢，處死大鼠后，迅速解剖并摘取一部分肝臟組織制備肝勻漿備檢，按照試劑盒要求測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“”表示，各組間計(jì)量資料比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹梔逍遙散對(duì)D-GaIN致急性肝損傷大鼠血清AST、ALT含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清AST與ALT均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，丹梔逍遙散高、中、低劑量組大鼠血清AST、ALT活性均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清AST、ALT含量比較 （n=10，）

表1 各組大鼠血清AST、ALT含量比較 （n=10，）

注：與空白組比較**P＜0.01；與模型組比較##P＜0.01。

組 別 藥物劑量（g/kg） AST(U/L) ALT(U/L)空白組 — 172.98±16.87 60.48±9.37模型組 — 12 079.42±582.72** 7 658.66±442.18**聯(lián)苯雙酯組 0.013 5 3 034.1±501.68## 2 253.18±301.06##丹梔高劑量組 15.33 3 457.07±349.40## 3 697.10±499.98##丹梔中劑量組 7.66 6 033.90±871.34## 4 130.62±445.88##丹梔低劑量組 3.83 7 118.2±1 101.12## 5 999.14±602.28##

2.2 丹梔逍遙散對(duì)D-GaIN致急性肝損傷大鼠肝勻漿中SOD、MDA、GSH-PX含量的影響

與空白組比較，模型組肝勻漿SOD與GSH-PX含量明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組、丹梔逍遙散高、中劑量組肝勻漿SOD與GSH-PX含量明顯升高，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；低劑量組肝勻漿SOD含量升高，MDA含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；但GSH-PX含量升高不明顯。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠肝勻漿中SOD、MDA、GSH-PX含量比較（n=10，）

表2 各組大鼠肝勻漿中SOD、MDA、GSH-PX含量比較（n=10，）

注：與空白組比較 **P＜0.01；與模型組比較 #P＜0.05，##P＜0.01。

組 別 SOD(U/mg) MDA（nmol/mL） GSH-PX（U/mL）空白組 0.42±0.01 13.58±1.65 101.56±24.97模型組 0.34±0.01** 50.04±14.39** 70.30±5.02**聯(lián)苯雙酯組 0.40±0.01## 15.49±3.74## 85.12±5.06##丹梔高劑量組 0.39±0.02## 15.11±3.04## 77.18±2.62##丹梔中劑量組 0.36±0.02## 16.08±3.74## 74.22±2.77#丹梔低劑量組 0.36±0.02## 20.79±3.94## 71.12±1.44

3 討論

D-GaIN致肝損傷模型是經(jīng)典的動(dòng)物模型之一，較四氯化碳（CCl4）方便，且可逆性和重復(fù)性較好，與人類病毒性肝炎的病理機(jī)制十分相似，是目前公認(rèn)的比較好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

D-GaIN不是直接殺死肝細(xì)胞的原漿毒，而是間接作用的肝毒劑。對(duì)肝臟的損傷主要是通過肝細(xì)胞內(nèi)尿苷二磷酸（UDP）奪獲，影響肝細(xì)胞的能量代謝及DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成；與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜特異性結(jié)合，影響其完整性，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度；引起谷胱苷肽耗竭；釋放腫瘤壞死因子TNF-α，引起細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的[2]。更多的研究表明，D-GalN還通過產(chǎn)生自由基及其啟動(dòng)的脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)進(jìn)一步加劇肝細(xì)胞的損傷[3]。

SOD是超氧陰離子自由基的清除劑，可抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，其活力的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除自由基的能力[4]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死，其含量的高低間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[5]。二者聯(lián)合檢測(cè)可反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。GSH-PX可以清除自由活性氧，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。

丹梔逍遙散由柴胡、牡丹皮、炒山梔、當(dāng)歸、芍藥、茯苓、炒白術(shù)、炙甘草組成，具有疏肝清熱，養(yǎng)血健脾之功效。方中柴胡疏肝解郁，牡丹皮清血中之伏火，炒山梔清肝熱并導(dǎo)熱下行，當(dāng)歸養(yǎng)血和血，白芍養(yǎng)血斂陰，柔肝緩急，茯苓、白術(shù)、甘草益氣健脾。單味藥的研究結(jié)果表明[6-9]，柴胡對(duì)大鼠血清AST、ALT、ALP的升高和TP的降低有一定程度的抑制作用，能改善肝臟的纖維化程度；牡丹皮可顯著降低D-GaIN誘導(dǎo)的急性化學(xué)性肝損傷大鼠血清AST、ALT、ALP含量，病理檢查結(jié)果也顯示其有明顯的保肝作用；梔子提取物可使D-GaIN肝損傷模型小鼠血清AST、ALT活性下降，肝細(xì)胞壞死、肝細(xì)胞變性等明顯改善；當(dāng)歸能明顯提高大鼠肝細(xì)胞SOD活力，降低MDA含量，具有明顯的抗肝損傷作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹梔逍遙散能明顯抑制DGaIN所致急性肝損傷大鼠血清ALT、AST的活性，升高肝勻漿中SOD、GSH-PX的含量，降低MDA含量，對(duì)受損肝臟的保護(hù)機(jī)制可能與保護(hù)肝細(xì)胞膜的完整性、增強(qiáng)機(jī)體清除自由基能力、減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1]吳少東，何建萍.丹梔逍遙散的臨床應(yīng)用[J].陜西中醫(yī)，2008，29(4)：494-495.

[2]李宏濤，陳國(guó)民.D-氨基半乳糖研究的回顧和展望 [J].肝臟，2004，9(3)：209-210.

[3]趙志泉，徐順福，陳國(guó)興，等.休克/再灌注肝損傷中氧自由基的作用[J].中華消化雜志，1994，14(2):82-85.

[4]陳雪龍.實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2008，25(3):47.

[5]Ahn TH， Yang YS， Lee JC， Moon CJ， Kim SH， Jun W，Park SC，Kim JC.Ameliorative effects of pycnogenol on carbon tetrachloride-induced hepatic oxidative damage in rats[J].Phytother Res，2007（21）：1 015-1 019.

[6]KanbagliO， Balkan J， Aykac TokerG， etal.Hepatic mitochondrial prooxidant and antioxidant status in ethanol induced liver injury in rat[J].Biol Pharm Bull，2002，25(11)：1 482-1 484.

[7]鄭純威，丁華熳，陳 宇，等.柴胡皂苷改善大鼠纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2011，20(5):755.

[8]陳金英，李向陽.丹皮總苷防治大鼠急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2009，9(3):64-66.

[9]陳 明，龍子江，王 靚.梔子提取物保肝利膽作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2006，18(6):610-611.

[10]田紅劍，陳 斌.當(dāng)歸對(duì)大鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用[J].中南藥學(xué)，2003，1(5)：271.

（本文編輯 彭芝配）

Experimental study of protective effects of Danzhi Xiaoyao powder on acute liver injury caused by D-galactosamine in rats

ZENG Xiao-yan1， LIAO Liang-ying2， JIANG Fan2， TAN Zhao-yang3， YANG Xian-guo3，CHEN Gui-hai2
(1.TCM College of Guangxi， Nanning， Guangxi 530001， China;2.First Affiliated Hospital,TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410208,China；3.TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To investigate the protective effects of Danzhi Xiaoyao powder on acute liver injury caused by D-galactosamine in rats.Methods 60 male SD rats were randomly divided into control group，model group，bifendate group，and Danzhi Xiaoyao powder low，middle，high dosage group，10 rats in each group.Other rats were injected intraperitoneally with DGaIN except the control group with the same volume of saline after they were performed by gavage once a day and lasted for 7 days.After injected 24 hours，the contents of AST， ALT in serum and the contents of SOD，GSH-PX，MDA in liver tissue were measured.Results Danzhi Xiaoyao powder significantly inhibited the increasing ALT and AST contents in serum and MDA contents in liver tissues and improved the contents of SOD和GSH-PX in liver tissues caused by D-GaIN.Conclusion Danzhi Xiaoyao powder has protective effects on acute liver injury in rats caused by D-GaIN.

Danzhi Xiaoyao powder； acute liver injury； D-GaIN； rats

*陳貴海，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mali：cg98643@163.com。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.05.007.032.03

2012－03－02

湖南省中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)資助項(xiàng)目（201105）。

曾曉艷（1982-），女，湖南湘鄉(xiāng)人，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)基礎(chǔ)理論氣化研究。