液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定養(yǎng)殖魚中痕量安眠酮的殘留量

于慧娟，沈康俊，李向軍，惠蕓華，金高娃，黃冬梅，蘇 惠

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)，上海 200090；3.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023）

安眠酮又稱甲苯喹啉酮（methaqualone，C16H14N2O），白色結(jié)晶粉末，無臭、微苦，熔點(diǎn)120℃，微溶于水，易溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等，具有吸濕、鎮(zhèn)靜和催眠的作用。安眠酮系喹唑酮類衍生物，臨床上常用作催眠藥、鎮(zhèn)定藥，主要用于動(dòng)物過度興奮或驚厥，可使機(jī)體平靜；但該藥副作用較大，進(jìn)入人體后，會(huì)表現(xiàn)出惡心、嘔吐、頭暈、無力、四肢及口舌麻木，個(gè)別較重患者會(huì)有短時(shí)間的精神失常，過量服用可出現(xiàn)昏迷、心跳過速、呼吸抑制等癥狀；如果長(zhǎng)期攝入，人體可產(chǎn)生耐藥性。近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，一些不法分子在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)下，置法律法規(guī)于不顧，為達(dá)到保活、保重以及增加捕獲量的目的，在魚類產(chǎn)品運(yùn)輸和捕撈過程中擅自在飼料中非法添加安眠酮，導(dǎo)致該藥物在產(chǎn)品中的殘留，給食品安全帶來嚴(yán)重隱患。為嚴(yán)格控制安眠酮被非法使用，農(nóng)業(yè)部在235號(hào)公告中將安眠酮規(guī)定為“禁止使用的藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出”[1]。

目前安眠酮的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[2－3]、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法[4]、光譜法[5]、液相色譜法[6－8]和超高壓 液質(zhì)聯(lián) 用法等[9]，這些方法主要用于人體血漿、頭發(fā)及豬肉、豬腎和飼料中安眠酮的測(cè)定，而關(guān)于水產(chǎn)品中安眠酮的殘留檢測(cè)卻鮮有報(bào)道。本研究采用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)開發(fā)魚組織中痕量安眠酮的殘留檢測(cè)方法，探討樣品前處理方法，并對(duì)方法的有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為水產(chǎn)行業(yè)安眠酮?dú)埩魴z測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

TSQ Quantumn Acesses高效液相色譜－四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo－Fisher公司產(chǎn)品；3510超聲波清洗器；固相萃取裝置，Organomation氮吹儀：美國(guó)Supelco公司產(chǎn)品；TDL－60B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

1.2 主要試劑與材料

安眠酮（MTQ，1g/L甲醇溶液）、安眠酮同位素標(biāo)記物（MTQ－D7，1g/L 甲醇溶液）：購(gòu)自美國(guó)劍橋公司；甲醇、甲酸、正己烷、乙醚和丙酮（色譜純）：購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli－Q超純水；硅膠柱（3mL/500mg）：美國(guó)Supelco公司產(chǎn)品；樣品為均質(zhì)后的草魚、鱸魚和鰻鱺魚糜。

1.3 工作液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 采用逐級(jí)稀釋法用V（甲醇）∶V（水）＝1∶1的溶液將安眠酮配制成濃度分別為0.1、0.5、2.0、10、25和100μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，此工作液中均含有2μg/L MTQ－D7。

1.3.2 內(nèi)標(biāo)工作液的配制 采用逐級(jí)稀釋法用甲醇將安眠酮同位素標(biāo)記物溶液配制成濃度為50μg/L的工作液。

1.4 樣品前處理

稱取5.00g（精確到0.05g）已均質(zhì)好的樣品于50mL離心管中，加入100μL內(nèi)標(biāo)工作液，放置30min，使內(nèi)標(biāo)物完全滲透，然后加入3 mL水和15mL正己烷，用玻璃棒攪拌，分散均勻，超聲提取10min，震蕩提取3min以4 000 r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上層清液至25mL容量瓶中；殘?jiān)性偌尤?0mL正己烷，按上述方法重復(fù)提取1次，合并提取液，用正己烷定容至25 mL。取10mL提取液加入預(yù)先用5mL丙酮和5mL正己烷活化好的硅膠柱中，用10mL 25%的乙醚－正己烷混合液淋洗，棄去淋洗液；用8 mL 50%的乙醚－正己烷混合液洗脫，收集洗脫液于離心管中，吹氮濃縮至干。準(zhǔn)確加入1mL V（甲醇）∶V（水）＝1∶1的溶液溶解殘留物，經(jīng)0.22μm水相濾膜過濾后，供高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.5 液相色譜－質(zhì)譜條件

1.5.1 液相色譜條件 色譜柱：Capcell PAK MGⅡC18柱（100mm×2.1mm×3.0μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；梯度洗脫程序：0～1min、50%B，1～1.1min、50%～95%B，1.1～8min、95%B；流速0.3mL/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量20μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，噴霧電壓4 500V，離子傳輸毛細(xì)管溫度350℃，源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離電壓10V，鞘氣流速11.0L/h，輔助氣流速為6.0L/h。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞能量列于表1。

表1 安眠酮的監(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞能量Table 1 Optimized multiple reaction monitoring parameters and collision energy for methaqualone

2 結(jié)果與討論

2.1 離子源條件的優(yōu)化及安眠酮定性、定量信息的確定

將濃度為1mg/L安眠酮標(biāo)準(zhǔn)溶液以蠕動(dòng)泵進(jìn)樣方式注入質(zhì)譜儀中，在m/z 150～500掃描范圍內(nèi)以正離子模式對(duì)其進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，以確定安眠酮分子的[M＋1]＋峰；以分子離子峰為母離子，對(duì)離子源參數(shù)（噴霧電壓、鞘氣、輔助氣、源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離電壓）進(jìn)行優(yōu)化，使質(zhì)譜儀的測(cè)定靈敏度達(dá)到最高；然后在一定的碰撞能量下對(duì)安眠酮的子離子進(jìn)行全掃描，以確定安眠酮的主要離子碎片，二級(jí)質(zhì)譜掃描圖示于圖1。由圖1可以看出，安眠酮可產(chǎn)生3個(gè)主要碎片離子，分別為m/z 91.19、117.16和132.17，結(jié)合樣品空白基質(zhì)的質(zhì)譜圖選取離子豐度最高、本底干擾最小的m/z 251.1/91.19為定量離子對(duì)，m/z 251.1/132.17和 m/z 251.1/117.1為定性離子對(duì)。

2.2 樣品前處理方法的研究

2.2.1 提取劑及提取方式的優(yōu)化 為了使水產(chǎn)品中殘留的安眠酮提取效果達(dá)到最高，綜合安眠酮的性質(zhì)，分別采用正己烷和乙腈為提取劑進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，通過比較回收率大小來評(píng)價(jià)提取劑的提取效果。具體方法為：分別在5g草魚陰性樣品中加入100ng安眠酮標(biāo)準(zhǔn)品，不加內(nèi)標(biāo)物，然后用乙腈和正己烷分別進(jìn)行提取，經(jīng)濃縮、凈化后，按1.5.1條件進(jìn)行分析，通過比較回收率的大小來評(píng)價(jià)提取劑的提取效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：正己烷的提取效率為85%，而乙腈的提取效率為93%。雖然乙腈的提取效率大于正己烷，但用乙腈作提取劑時(shí)，乙腈需蒸干，且在蒸干過程中因提取液中含有少量的水，易產(chǎn)生爆沸現(xiàn)象，使蒸發(fā)濃縮過程難以控制，后處理麻煩；而用正己烷作提取劑，提取液可直接用硅膠柱進(jìn)行凈化，操作簡(jiǎn)便容易控制，所以將正己烷確定為最佳提取劑。

由于水產(chǎn)品的水分較高，使樣品在正己烷中分散不好，故本實(shí)驗(yàn)選擇先加入3mL水使魚類樣品在水中分散后，再用正己烷提取的樣品前處理方法。

圖1 安眠酮的子離子掃描圖Fig.1 Product ion scans spectra for methaqualone

2.2.2 硅膠柱對(duì)安眠酮吸附性能的研究及洗脫劑配比的優(yōu)化 樣品用正己烷提取后，提取液中含有大量的脂溶性雜質(zhì)，這些雜質(zhì)如不去除，將會(huì)污染色譜柱和離子源，影響安眠酮的定性與定量。安眠酮屬于脂溶性物質(zhì)，較易溶于正己烷，所以不能采用常規(guī)的正己烷液－液萃取凈化方法。本實(shí)驗(yàn)使用極性硅膠柱凈化，通過分析上樣流出液中安眠酮的濃度，確定硅膠柱是否能夠吸附安眠酮。具體實(shí)驗(yàn)方法為：選用規(guī)格為3mL/500mg極性硅膠柱；將陰性的草魚和鱸魚樣品用25mL正己烷提取2次，提取液經(jīng)離心合并后，加入250ng安眠酮；取10mL提取液用硅膠柱凈化，接收上樣流出液，取5mL流出液用氮?dú)獯蹈?，然后?mL V（甲醇）∶V（水）＝1∶1的溶液溶解，上機(jī)分析，看上樣流出液中是否有安眠酮被檢出。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，草魚和鱸魚上樣流出液中沒用安眠酮的存在，所以可以認(rèn)為硅膠柱對(duì)安眠酮有良好的吸附性能，適用于提取液中安眠酮的富集。

將吸附有安眠酮的硅膠柱分別用8mL 25%、35%、40%、50%的乙醚－正己烷混合溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，?mL V（甲醇）∶V（水）＝1∶1的溶液溶解，上機(jī)測(cè)定，通過比較回收率的大小來尋找最佳洗脫劑配比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2。可以看出，隨著洗脫劑中乙醚比例的增加，安眠酮的回收率從0上升至95%以上，所以最佳洗脫劑為V（乙醚）∶V（正己烷）＝1∶1的洗脫液。

表2 不同洗脫劑條件下安眠酮的回收率Table 2 Recoveries of methaqualone in different eluting agent

2.3 方法有效性評(píng)價(jià)

2.3.1 選擇性評(píng)價(jià) 按照1.4和1.5處理鰻鱺、鱸魚、草魚的空白樣品和加標(biāo)樣品，通過分析空白樣品和加標(biāo)樣品色譜峰的出峰情況，考察方法的選擇性。樣品空白譜圖及加標(biāo)譜圖示于圖2～5。圖2～4為3種空白樣品譜圖，圖5為定量限下鰻鱺加標(biāo)譜圖。經(jīng)空白樣品與加標(biāo)樣品譜圖對(duì)比分析可以看出，3種空白樣品在安眠酮出峰處基質(zhì)干擾很小，樣品中安眠酮的定性與定量準(zhǔn)確，所以該分析方法選擇性高。

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度 分別以陰性的草魚、鱸魚和鰻鱺為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，通過標(biāo)準(zhǔn)添加實(shí)驗(yàn)考察方法的準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性及對(duì)不同種類魚的適用性。實(shí)驗(yàn)按1.4和1.5進(jìn)行，安眠酮的添加水平分別為0.2、0.5、1.0和20μg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平做5個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)5次加標(biāo)，批內(nèi)和批間測(cè)定結(jié)果列于表3和表4。

圖2 鱸魚空白樣品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.2 Chromatograms of Japanese sea bass blank sample by MRM mode

圖3 鰻鱺空白樣品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.3 Chromatograms of marbled eel blank sample by MRM mode

由表3和表4可知，3種受測(cè)水產(chǎn)樣品的實(shí)際加標(biāo)回收率均大于80%，信噪比≥10，精密度小于15%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均能滿足藥殘檢測(cè)的要求，由此證明該方法適用于不同種類魚類樣品中安眠酮?dú)埩舻臏y(cè)定。

圖4 草魚空白樣品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.4 Chromatograms of grass carp blank sample by MRM mode

圖5 鰻鱺加標(biāo)樣品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖（0.2μg/kg）Fig.5 Chromatograms of marbled eel blank sample spiked with methaqualone by MRM mode（0.2μg/kg）

表3 魚肌肉中安眠酮批內(nèi)回收率和精密度（n＝5）Table 3 The intra－batch recovery and RSD of methaqualone in fish

表4 魚肌肉中安眠酮批間回收率和精密度（n＝5）Table 4 The inter－batch recovery and RSD of methaqualone in fish

2.3.3 檢出限、定量限及線性范圍 為確定方法的定性檢出限和定量限，分別處理草魚、鱖魚和鰻鱺空白樣品，考察空白樣品的背景值，確定方法的定性檢出限為0.05μg/kg（S/N≥3），定量限為0.20μg/kg（S/N≥10），定量限下批內(nèi)和批間測(cè)定結(jié)果列于表3和表4。

將安眠酮配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)分析，以安眠酮與安眠酮同位素標(biāo)記物（MTQD7）的峰面積比為縱坐標(biāo)，安眠酮濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，安眠酮在1～100μg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2大于0.998 2，回歸方程為y＝0.225 67x＋0.000 677 6。

2.4 方法應(yīng)用

應(yīng)用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法分別對(duì)上海農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的鰻魚、鱸魚、鱖魚和大黃魚等魚類樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、適用性強(qiáng)，適用于魚類樣品中痕量安眠酮?dú)埩袅康臏y(cè)定。

[1]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告，第235號(hào).

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