胃癌細胞系幽門螺桿菌感染對HIF-1α、HIF-2α及VEGF表達的影響

吳海濱 張樂鳴

胃癌是常見的惡性腫瘤，位居腫瘤死因和常見腫瘤的第2位和第4位［1］。目前，外科手術(shù)和抗腫瘤治療未能改善胃腺癌的不良預(yù)后，5年生存率僅是5% ～17%，其浸潤和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的主要因素［2］。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H．pylori)已經(jīng)被確認為胃癌的重要病因之一，其與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)。研究顯示幽門螺桿菌陽性的胃癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且動物實驗表明幽門螺桿菌能促進胃癌的肺轉(zhuǎn)移［3，4］。長期隨訪研究顯示根除幽門螺桿菌可逆轉(zhuǎn)胃癌癌前病變，提示幽門螺桿菌有促進胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的作用［5］。魏軍等發(fā)現(xiàn)H．pylori-L型感染增強了胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［6］。目前H．pylori與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的確切機制尚不完全清楚。而血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移重要因子，HIF-1α和 HIF-2α可調(diào)控VEGF的表達，是惡性腫瘤誘導(dǎo)新生血管形成的主要調(diào)控因子。因此，我們把H．pylori與人胃腺癌細胞株BGC-823共培養(yǎng)，觀察BGC-823細胞增殖情況并對HIF-1α、HIF-2α及VEGF表達情況進行檢測，以探討幽門螺桿菌感染對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及可能誘導(dǎo)胃癌血管生成機制。

材料與方法

1．材料:RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自(GIBoC公司);胎牛血清(FCS，杭州四季青公司);5%四甲基偶氮唑藍(MTT溶液，上海華美生物工程公司)，總RNA提取試劑Trizol(北京天根公司);MMIV第1鏈cDNA合成試劑盒及PCR擴增試劑盒(fermentas);1000bp DNA ladder及PCR引物由上海生物工程公司合成。微需氧產(chǎn)氣袋(oxoid公司);哥倫比亞血平板(梅里埃公司);兔抗人HIF-1α和HIF-2α抗體(Genetex公司);VEGF多克隆抗體(北京博奧森公司);HRP標記的羊抗兔二抗購自(北京博奧森公司);ECL試劑盒購自美國Thermo公司;RIPA蛋白裂解液及BCA蛋白定量試劑盒購自江蘇碧云天公司。H．pylori國際標準菌株(NCTC11637)由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院饋贈，人胃腺癌細胞株BGC-823購自杭州澤衡生物科技有限公司。

2．方法:(1)細胞培養(yǎng):選用人胃腺癌細胞株BGC-823，在含10%FCS的RPMI1640細胞培養(yǎng)基中加青霉素100U/ml及鏈霉素100mg/ml，37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)。(2)H．pylori菌懸液的制備:在無菌條件下，以劃線培養(yǎng)方式將H．pylori接種于哥倫比亞血平板，置于37℃微需氧袋中培養(yǎng)，3～5天后收集針尖樣透明菌落，用PBS制成懸液，于分光光度計上調(diào)節(jié) H．pylori濃度至1×108CFU/ml(A660=l×108CFU/ml)，并將H．pylori菌液連續(xù)4次作10倍稀釋調(diào)節(jié)至(1×103CFU/ml、1 × 104CFU/ml、1 × 105CFU/ml、1 × 106CFU/ml和 1 ×107CFU/ml)。(3)MTT法檢測細胞存活率:BGC-823細胞接種于5×105每孔含潔凈小蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，每個樣本做3個復(fù)孔，過夜，待細胞貼壁后，加入不同濃度的H．pylori懸液，其中加入 1 ×103CFU/ml、1 ×104CFU/ml、1 ×105CFU/ml、1 ×106CFU/ml和 l×107CFU/ml的 H．pylori活菌懸液分別稱為試驗組1、試驗組2、試驗組3、試驗組4和試驗組5，對照組加稀釋用培養(yǎng)液，每種細胞重復(fù)3孔。與BGC-823細胞共孵育12、24、36和48h后棄培養(yǎng)液，每孔加MTT 20μl(濃度為5mg/ml)，放置孵箱內(nèi)4h后棄上清加入10%的SDS 200μl，過夜。震蕩15min，用全自動酶標儀(美國Biorad公司)檢測570nm處的吸光度值(A值)。計算細胞存活率(%)=實驗組A值/對照組A值。(4)H．pylori懸液和BGC-823細胞共培養(yǎng):①取對數(shù)生長期的BGC-823細胞用含0．2g/L EDTA和1．5g/L胰蛋白酶消化后計數(shù)，接種于5×105每孔含潔凈小蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中，過夜;②將稀釋好的H．Pylori活菌懸液加入過夜后貼壁的BGC-823細胞中，加入1×103CFU/ml、1 ×104CFU/ml、1 ×105CFU/ml的 H．Pylori活菌懸液分別稱為試驗組1、試驗組2和試驗組3，對照組加稀釋用培養(yǎng)液，每種細胞重復(fù)3孔;③培養(yǎng)24h后收集細胞，分別進行RTPCR、Western blotting檢測。(5)RT-PCR 檢測 HIF-1α，HIF-2α和VEGFmRNA的表達:用RNA提取試劑Trizol提取總RNA，紫外分光光度計測樣品濃度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，用MMLV第1鏈cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按說明書操作。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)(95℃預(yù)變性 3min，94℃變性 1min，55℃復(fù)性 1min，72℃延伸 1min，30 個循環(huán)，72℃延伸10min)。HIF-1α的引物上游為;5'AGCCGCTGGAGACACAAT-3'和下游為5'-TCGGAAGGACTAGGTGTCTGA-3'，擴增長度為302bp;HIF-2α的引物上游為;5'-CCCTTCCTCCTGGACAAGTTTC-3'，下游為 5'-CCCTGAGGTTCTTCATCCGTTT-3'，擴增長度為490bp;VEGF的引物上游為:5'GCCTTGCTGCTCTACCTC-3'，下游為5'GGCACACAGGATGGCTTG-3'，擴增長度為200bp;內(nèi)對照β-actin的引物上游為:5'-ACGGCATCGTCACCAACT-3'和下游為5'-CAATGCCAGGGTACATGGT-3'，擴 增 長 度 為 710bp。PCR擴增產(chǎn)物用1．5瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色顯示，用Quantity One凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，以 HIF-1α、HIF-2α mRNA/β-actin mRNA電泳帶的吸光度比值作為HIF-1α、HIF-2α及VEGF mRNA的相對表達量指標。(6)Western blotting檢測HIF-1α，HIF-2α和VEGF蛋白表達:棄培養(yǎng)液后PBS沖洗細胞3次，加入預(yù)冷的RIPA裂解液150μl，RIPA裂解液預(yù)先加PMSF 1．5μl使終濃度為1mmol/L。操作于冰上進行，4℃下10000r/min(離心半徑為4cm)離心5min取上清液，BCA法測蛋白濃度后，99℃ 變性10min。取50μg蛋白行10%SDSPAGE電泳，半干法電轉(zhuǎn)移法100V恒壓電泳1h，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。室溫下用脫脂奶粉封閉1h后加一抗(兔抗人HIF-1α、HIF-2α，和 VEGF多克隆抗體，工作濃度是1∶1000)，4℃孵育過夜，洗膜;加HRP標記的二抗(羊抗兔 IgG抗體，工作濃度1∶1000)，37℃，孵育 1h，ECL 試劑于暗室自顯影。Western blotting圖像存入計算機，用ImageJ 1．44p圖像分析軟件包進行光密度計算。

3．統(tǒng)計學(xué)方法:本研究采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，進行ANOVA檢驗，檢驗水準α=0．05，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．MTT法檢測細胞存活率:MTT法檢測細胞存活率見圖1，表1，BGC-823細胞與低濃度的H．pylori懸液(1×103CFU/ml、1×104CFU/ml和 1×105CFU/ml)共孵育 12、24、36、48h 后，實驗組細胞存活率較對照組顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。與高濃度的 H．pylori懸液(1 ×106CFU/ml和1 ×107CFU/ml)共孵育 12、24、36、48h 后，實驗組細胞存活率較對照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0．05)。

圖1 BGC-823細胞與不同濃度的H．pylori懸液共孵育后細胞存活曲線(MTT法)

2．BGC-823細胞 HIF-1α 、HIF-2α 及 VEGF mRNA的表達:RT-PCR電泳結(jié)果見圖2，mRNA相對表達量見表2。表2顯示，H．pylori刺激24h后，對照組和試驗組比較，試驗組1、試驗組2和試驗組3與對照組比較條帶明顯變寬，試驗組1、試驗組2、試驗組3與對照組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。隨著試驗組H．pylori濃度的增加，條帶逐漸變寬。

表1 MTT法檢測細胞存活率(%，±s，n=3)

表1 MTT法檢測細胞存活率(%，±s，n=3)

時間(h)細胞存活率(%)實驗組1 實驗組2 實驗組3 實驗組4 實驗組5 12 110．33 ±2．51 120．33 ±1．53 133．67 ±2．51 81．67 ±153 64．33 ±4．16 24 124．67 ±4．16 134．67 ±4．16 155．67 ±2．52 45．67 ±4．16 32．33 ±1．53 36 146．330 ±3．78 154．67 ±4．16 176．33 ±1．53 19．33 ±1．53 14．67 ±1．53 48 174．67 ±1．52 196．67 ±1．52 225．33 ±1．52 9．33±1．52 2．67 ±0．58

圖2 RT-PCR檢測

表2 HIF-1α、HIF-2α及VEGF mRNA相對表達量(±s，n=3)

表2 HIF-1α、HIF-2α及VEGF mRNA相對表達量(±s，n=3)

VEGF對照組組別 n HIF-1α HIF-2α 3 0．43 ±0．04 2．07 ±0．02 1．31 ±0．11實驗組1 3 0．79 ±0．04 2．41 ±0．02 1．67 ±0．04實驗組2 3 0．99 ±0．05 2．84 ±0．05 2．06 ±0．04實驗組3 3 1．28 ±0．05 3．14 ±0．09 2．39 ±0．06

3．BGC-823細胞 HIF-1α 、HIF-2α 及 VEGF蛋白的表達:Western blotting檢測結(jié)果見圖3、表3。表3顯示H．pylori刺激24h后，對照組和試驗組比較，試驗組1、試驗組2和試驗組3與對照組比較條帶明顯變寬，試驗組1、試驗組2、試驗組3和對照組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。隨著試驗組H．pylori濃度的增加，條帶逐漸變寬。

圖3 Western blotting檢測BGC-823細胞HIF-1α、HIF-2α及VEGF蛋白的表達

表3 各組BGC-823細胞HIF-1α、HIF-2α及VEGF蛋白的表達(±s，n=3)

表3 各組BGC-823細胞HIF-1α、HIF-2α及VEGF蛋白的表達(±s，n=3)

VEGF對照組組別 n HIF-1α HIF-2α 3 0．22 ±0．02 0．43 ±0．05 0．181 ±0．03實驗組1 3 0．39 ±0．01 0．81 ±0．03 0．545 ±0．01實驗組2 3 0．81 ±0．01 1．05 ±0．12 0．874 ±0．04實驗組3 3 1．08 ±0．15 1．37 ±0．08 1．153 ±0．06

討 論

有研究報道AGS細胞與H．pylori活菌上清活菌體破裂物共培養(yǎng)后，其增殖速度加快，表明H．pylori活菌與胃癌增殖具有相關(guān)性。吳海波等研究發(fā)現(xiàn)H．pylori-L型作用BGC-823細胞后，細胞分裂增多，增殖旺盛，瘤巨細胞增多，出現(xiàn)明顯的生長加速現(xiàn)象［7］。吳鶯等［8］研究發(fā)現(xiàn) H．pylori超聲提取液可誘導(dǎo)胃癌細胞BGC-823細胞出現(xiàn)蜂鳥表型，凋亡抑制基因Survivin mRNA表達上調(diào)、凋亡基因caspase-3 mRNA表達下降，表明H．pylori可能通過上調(diào)凋亡抑制基因survivin、下降凋亡基因caspase-3的表達來促進BGC-823細胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，當H．pylori懸液濃度在低濃度(1×103CFU/ml、1×104CFU/ml和1×105CFU/ml)時能顯著促進BGC-823細胞的增殖，且隨著濃度的增加和作用時間的延長，BGC-823細胞的增殖呈增高趨勢，而高濃度的H．pylori懸液(1×106CFU/ml和1×107CFU/ml)顯著抑制BGC-823細胞的增殖，且隨著濃度的增加和作用時間的延長，BGC-823細胞的抑制呈增高趨勢，說明H．pylori感染濃度和時間可能對胃癌的生長起重要作用。因此，我們選擇低濃度的H．pylori懸液與BGC-823細胞共培養(yǎng)24h后，檢測 HIF-1α、HIF-2α及VEGF表達情況。

有研究發(fā)現(xiàn)，H．pylori陽性的胃癌細胞血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)比H．pylori陰性的胃癌細胞過表達，并表現(xiàn)出更強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［9，10］。而腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過程與新生血管生成密切相關(guān)，腫瘤的生長和浸潤轉(zhuǎn)移依賴于血管生成，VEGF是腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生新生血管的最重要的細胞因子。本實驗結(jié)果顯示H．pylori感染人胃癌細胞BGC-823 24h后VEGF過表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，并且隨著 H．pylori濃度的增加，VEGF呈增高趨勢，提示H．pylori感染可能通過刺激VEGF表達而影響腫瘤新生血管的生成，從增加胃癌細胞的浸潤轉(zhuǎn)移能力。

腫瘤血管的生成需要促血管生成因子的作用，研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α和HIF-2α是重要的促血管生成因子，HIF-1α和HIF-2α可調(diào)控VEGF的表達。研究證實缺氧或某些基因突變可活化HIF-1α與VEGF基因的調(diào)控序列相結(jié)合，從而啟動VEGF的轉(zhuǎn)錄。而本研究中，H．pylori感染人胃腺癌細胞BGC-823 24h后可顯著提高HIF-1α mRNA和蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，并且隨著H．pylori濃度的增加，HIF-1α表達呈增高趨勢。提示VEGF的表達可能是H．pylori通過HIF-1α途徑來調(diào)控的。馮玉光等在尼美舒利對氯化鈷誘導(dǎo)的BGC-823細胞HIF-1α及VEGF表達的影響是發(fā)現(xiàn)，氯化鈷刺激BGC-823細胞24h，可顯著提高細胞HIF-1α蛋白、VEGF mRNA和蛋白的表達(P＜0．01)，但對 HIF-1αmRNA 表達無影響［11］。而本實驗證實 H．pylori可能通過HIF-1α在基因水平和蛋白水平調(diào)控VEGF表達。

Song等［12］在研究胃癌血管生成和糖代謝相關(guān)的靶基因的調(diào)節(jié)時發(fā)現(xiàn)，增強缺氧時胃癌血管內(nèi)皮生長因子和葡萄糖代謝相關(guān)基因表達的是HIF-1α和HIF-1β，而不是 HIF-2α。本實驗發(fā)現(xiàn) H．pylori感染人胃癌細胞BGC-823 24h后可顯著提高HIF-2αmRNA和蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，并且隨著 H．pylori濃度的增加，HIF-2α 呈增高趨勢。提示H．pylori增強VEGF的表達也可能是通過增加HIF-2α來調(diào)控的，且HIF-2α可能是在基因水平和蛋白水平調(diào)控VEGF表達。

本實驗發(fā)現(xiàn)低濃度的H．pylori懸液可顯著增加胃癌細胞BGC-823的增殖，并能提高HIF-1α、HIF-2α和VEGF表達，這可能是H．pylori促進胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的機制之一。本研究結(jié)果為臨床上針對H．pylori抗陽性的胃癌病人，根除H．pylori降低胃癌細胞增殖速度，減少HIF-1α、HIF-2α和VEGF表達，對控制胃癌細胞增殖速度和胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移有一定的指導(dǎo)意義。也為針對HIF-1α、HIF-2α和VEGF等抗胃癌血管生成的靶向治療提供初步的理論依據(jù)。目前，已提出了針對HIF-1α轉(zhuǎn)錄翻譯、上游信號活化、信號傳導(dǎo)通路、下游效應(yīng)分子等新靶向HIF-1α轉(zhuǎn)錄因子治療胃癌的新思路［13］。由于HIF-2α在腫瘤組織和血管內(nèi)皮的表達比HIF-1α更強烈，以HIF-2α為靶點的抗血管生成治療與HIF-1α和傳統(tǒng)細胞毒藥物、腫瘤免疫療法相結(jié)合的治療方法，有望在H．pylori陽性的胃癌患者在治療上有所突破。

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