基因工程丁肝抗原的獲取和鑒定

丁軍穎 邱 豐 蘇秋東 盧學(xué)新 伊 瑤 畢勝利

隨著人們對丁型肝炎病毒(HDV)研究的深入，采用基因工程技術(shù)獲取具有生物活性的重組丁肝抗原(HDAg)成為解決丁肝診斷研究中HDAg來源困難的一個重要途徑。丁肝抗原的測定是診斷和監(jiān)測丁肝的主要手段，為提高檢測丁肝抗原的ELISA診斷試劑質(zhì)量，高效低成本制備純度好且效價高的HDAg尤為重要。為此，本實驗采用人工編碼的小分子質(zhì)量丁肝抗原(small－HDAg，S－HDAg)基因，以本室改造的 M48為載體，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化BL21篩選基因工程菌，最后，利用該載體自身具備的6個組氨酸標(biāo)簽進(jìn)行純化，以期得到有生物活性的基因工程丁肝抗原蛋白，供丁肝ELISA診斷試劑的研發(fā)使用。

材料與方法

1.材料:丁肝小抗原優(yōu)化基因(北京六合通公司);表達(dá)載體M48由本室從商品化質(zhì)粒PET43a改造并留存;T4DNA連接酶(北京六合通公司);限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ(北京六合通公司);DNA提取試劑盒(美國，Promega);水平電泳系統(tǒng)(北京六一電泳儀廠);BL21感受態(tài)(北京六合通公司); DH5α感受態(tài)(北京六合通公司);XMTD－6000電熱恒溫水槽(北京長風(fēng)儀器儀表公司);LB培養(yǎng)基(美國，Sigma);IPTG誘導(dǎo)劑(美國Sigma);TZ－2H臺式恒溫振蕩培養(yǎng)箱(北京，沃德創(chuàng)新醫(yī)藥科技中心);垂直電泳系統(tǒng)(美國，Bio－rad);蛋白Marker(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院);His介質(zhì)(美國，GE);蛋白預(yù)染Marker(北京紐英倫生物技術(shù)北京有限公司); Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)和Image Lab分析軟件(美國，Bio－rad);H－15FR低溫離心機(jī)(美國，KOKUSAN);GGT－900超凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠);半干轉(zhuǎn)膜儀(美國，BIO－RAD);兔抗人IgG(北京樂博生物科技有限公司);牛血清白蛋白(北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司);硝酸纖維素膜(北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司);TMB(美國，Sigma);丁型肝炎病毒抗體診斷試劑盒(北京貝爾生物工程有限公司)。

2.優(yōu)化密碼并全基因序列合成:人工編碼S－HDAg基因序列，并在兩端加酶切位點(5'為NcoⅠ;3'為XhoⅠ)和保護(hù)堿基。全基因序列由北京六合通公司合成，命名為T－D。

3.質(zhì)粒構(gòu)建并鑒定:將T－D用NcoⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，獲取目的基因，將此基因連接M48載體，構(gòu)建質(zhì)粒M48－D，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑選陽性克隆，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖電泳鑒定。同時送至北京六合通公司測序鑒定。

4.蛋白表達(dá)并鑒定:將質(zhì)粒M48－D轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，挑選陽性克隆接種于1.5m l含100mg/L Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃，240r/min，培養(yǎng)3h，取菌留存;取該菌種按1∶1000分別接種于含100mg/L Amp的LB培養(yǎng)基中，30℃，240r/min，過夜培養(yǎng);以含200mg/L Amp的LB培養(yǎng)基做倍比稀釋，37℃，240r/min，培養(yǎng)1h后加IPTG至終濃度為0.25mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)1h，收獲菌液。取500μl上述菌液，10000r/min，離心1min，棄上清，以50μl雙蒸水充分重懸，再加等體積2×Buffer，混勻，煮沸3min，取樣20μl，以5%濃縮膠和12%分離膠進(jìn)行常規(guī)SDS－PAGE

5.蛋白純化并鑒定 :將上述菌液以4000r/min，離心10min，棄上清;以菌體裂解液(10mmol/L Tris－Hcl、0.5% Triton X－100、500mmol/L NaCl)重懸，在冰浴中以250W超聲破碎15min(24個循環(huán))。以12000r/min，離心10min，上清過鎳柱，以咪唑梯度洗脫，收集各峰，進(jìn)行常規(guī)SDS－PAGE，并以Image Lab軟件分析。

6.Western blotting檢測蛋白生物學(xué)活性:將SDS－PAGE分離膠中的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以丁肝陽性血清為一抗，兔抗人IgG為二抗，以TMB顯色，進(jìn)行常規(guī)Western blotting。

7.ELISA驗證蛋白生物學(xué)活性:將本研究表達(dá)的基因工程丁肝蛋白包被于聚丙乙烯板，以牛血清作為本底對照，將兩種物質(zhì)均用pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋，依次以10.0，8.0，6.0，4.0，2.0和1.0μg/m l的濃度進(jìn)行梯度包被和封閉，開展ELISA結(jié)合研究;以北京貝爾生物工程有限公司丁肝抗體ELISA診斷試劑作對照。

結(jié)果

1.密碼子優(yōu)化與全基因序列合成:對S－HDAg進(jìn)行人工編碼，并在5'和3'端設(shè)置酶切位點NcoⅠ和XhoⅠ，另加保護(hù)堿基，得到全基因，如下:

5'－CCCATGGGTC GTTCCGAATC ACGCAAACAT CGTGGTGGCC GTGAAGAAGC TCTTGAGCAA TGGATTTCTG GTCGTAAGAA ACTTGAAGAG CTTGAACGTG AGGCTCGTAA AATCAAAAAG AAAATCAAGA AACTTGAAGA CGACAATCCT TGGCTTGGTA ACGTTAAAGG TATTCTGGGC AAAAAGGACG AGGAAGGTGA AGGTGCACCT CCTGCTAAAC GCGCTCGTAC CGACCAGATG GAAGTTGACA CCGGTCCGCG TAAGCGTCCTCTGCGTGGCG GTTTCACAGA CAAAGAGCGT CAAGACCATC GCCGTCGTAA GGCTCTGGAA AATAAAAAGA AACAGCTTAC CGCAGGTGGT AAGTCTCTGT CTCGTGAGGA AGAGGAAGAG CTTAAACGTC TGACCGAAGA GGACGAACGT CGCGAGCGTC GTGTTGCGGG CCCCTCTGTT GGTGGTGTTA ACCCTCTGGA AGGTGGCTCC CGTGGTGCTC CTGGTGGTGG CTTCGTTCCT TCTATGCAAG GTATCCCTGA ATCTCCTTTT ACCCGTACAG GTGAAGGTCTGGACGTTCGT GGTGGTCAGG GTTTCCCGCT CGAGGC－3'。

2.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:北京六合通公司合成含目的基因序列的質(zhì)粒(T－D)，酶切后回收目的基因，連接到M48載體上。連接成功的質(zhì)粒(M48－D)雙酶切鑒定符合預(yù)期結(jié)果(圖1)。質(zhì)粒送公司測序鑒定，連接框架和準(zhǔn)確性均符合要求，說明成功構(gòu)建了M48－D重組表達(dá)質(zhì)粒。

圖1 M 48－D重組質(zhì)粒及其雙酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖1.雙酶切產(chǎn)物;M.DNA標(biāo)志(DL2000);2.M48－D質(zhì)粒

3.蛋白表達(dá)與純化:以重組質(zhì)粒M48－D轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS－PAGE顯示有外源蛋白表達(dá)，表觀分子質(zhì)量與預(yù)期大小一致，約為35kDa(圖2);經(jīng)超聲裂解證實，表達(dá)蛋白多為可溶性蛋白;裂解液重懸后離心收集上清，通過親和層析以梯度咪唑洗脫，SDS－PAGE電泳驗證，300mmol/L咪唑的洗脫峰主要是目的蛋白，收集此目的蛋白峰(圖3)。經(jīng)Image Lab軟件分析，獲得的蛋白濃度約為2g/L，純度＞90%。

圖2 不同陽性克隆的蛋白表達(dá)SDS－PAGE結(jié)果M.蛋白標(biāo)準(zhǔn);1～6.6個不同陽性克隆;C.陰性對照

4.蛋白生物學(xué)活性鑒定:Western blotting實驗結(jié)果(圖4)顯示，表達(dá)和純化的基因工程S－HDAg蛋白具備與丁肝抗體結(jié)合的生物活性。

圖3 表達(dá)蛋白親和層析的咪唑梯度洗脫SDS－PAGE結(jié)果

圖4 表達(dá)和純化蛋白的W estern blotting結(jié)果

5.蛋白生物學(xué)活性驗證:ELISA結(jié)合試驗結(jié)果顯示，表達(dá)純化的基因工程丁肝抗原蛋白與陽性血清能特異結(jié)合。梯度試驗顯示:顯色濃度與包被蛋白濃度呈正相關(guān)，兩者結(jié)合特異性較強。其中，當(dāng)包被濃度為2μg/m l(1∶1000稀釋度)時，可替代北京貝爾生物工程有限公司的相應(yīng)診斷試劑成分，用于ELISA檢測。

討論

HDV是1977年意大利的Rizzetto等［1］首先發(fā)現(xiàn)的。當(dāng)時曾被誤認(rèn)為是乙肝病毒新的抗原系統(tǒng)。1979～1980年經(jīng)黑猩猩試驗，證明是一種新病毒，需要嗜肝病毒(主要是乙肝病毒)輔助，尤其是外殼蛋白的合成，才能形成具有完整結(jié)構(gòu)的病毒顆粒［2，3］。1984年被正式命名為丁型肝炎病毒［4］。HDAg存在小分子質(zhì)量(24kDa)丁肝抗原(S－HDAg)和大分子質(zhì)量(27kDa)丁肝抗原(long－HDAg，L－HDAg)兩種形式，目前認(rèn)為可能是轉(zhuǎn)錄過程中存在特殊RNA編輯所致［5］。通過RNA編輯，S－HDAg的終止密碼子UAG變?yōu)閁GG，從而翻譯成為L－HDAg［6］。二者具有共同起始密碼并具有共同氨基酸終末序列，具有不同的終止密碼。除L－HDAg C端多19個氨基酸外，兩基因在序列上完全相同，事實上兩種形式來源于同一開放讀碼框(ORF)，即反基因組RNA上的ORF5［7］。本研究是依據(jù)在大腸桿菌中蛋白質(zhì)密碼子的使用頻率，對S－HDAg基因進(jìn)行人工編碼后開展的，以期構(gòu)建能高效表達(dá)的質(zhì)粒。

本研究選用含硫氧還蛋白(Trx)的原核表達(dá)系統(tǒng)，此系統(tǒng)尤其適用大量表達(dá)可溶性蛋白［8］。Trx相對分子質(zhì)量為12kDa，屬于進(jìn)化保守的家族，具有多個活性中心。其中，兩個半胱氨酸經(jīng)過可逆的氧化過程可將自身巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵，在與S－HDAg目的蛋白進(jìn)行融合表達(dá)時，有利于目的蛋白空間結(jié)構(gòu)的正確折疊，為其能具有生物活性提供有利條件［9～11］。即借助硫氧還蛋白的分子伴侶作用，確保大量表達(dá)的S－HDAg蛋白能正確折疊且表現(xiàn)出全部生物學(xué)活性［12］。

經(jīng)過不同載體的嘗試，本研究最終采用改裝后仍帶有組氨酸標(biāo)簽(His－tag)的M48載體來表達(dá)目的蛋白，以利于高效純化。該載體多克隆酶切位點上游有編碼6個組氨酸的基因序列，重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，組氨酸可與外源插入基因融合表達(dá)［13～16］。依據(jù)組氨酸與金屬鎳(Ni)之間的親和力所產(chǎn)生的螯合作用而設(shè)計的親和層析方法，是純化此種融合蛋白高效而簡單的方法［17］。表達(dá)蛋白的細(xì)胞沉淀經(jīng)裂解液溶解，上清經(jīng)鎳柱吸附，因咪唑與組氨酸有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可與組氨酸競爭性結(jié)合金屬鎳，所以咪唑置換可洗脫下特異結(jié)合的S－HDAg蛋白，從而獲取高純度的基因工程丁肝抗原。

本研究成功構(gòu)建了含S－HDAg優(yōu)化基因的重組表達(dá)質(zhì)粒和相應(yīng)的工程菌，并在含硫氧還蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)獲得高效表達(dá)，通過親和層析純化得到可與丁肝抗體結(jié)合的S－HDAg蛋白，為丁肝的ELISA診斷試劑研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 Rizzetto M，Canese MG，AricòS，etal.Immunofluorescence detection of new antigen－antibody system(delta/anti－delta)associated to hepatitis B virus in liver and in serum of HBsAg carriers［J］.Gut，1977，18(12):997－1003

2 Rizzetto M，Hoyer B，Canese MG，et al.Delta Agent:association of delta antigen with hepatitis B surface antigen and RNA in serum of delta－infected chimpanzees［J］.Proc Natl Acad SciU SA，1980，77 (10):6124－6128

3 Rizzetto M，Canese MG，Gerin JL，etal.Transmission of the hepatitis B virus－associated delta antigen to chimpanzees［J］.J Infect Dis，1980，141(5):590－602

4 Novick DM，F(xiàn)arci P，Karayiannis P，etal.Hepatitis D virusantibody in HBsAg－positive and HBsAg－negative substance abusers with chronic liver disease［J］.JMed Virol，1985，15(4):351－356

5 Volchkova VA，Dolnik O，Martinez MJ，et al.Genomic RNA editing and its impact on Ebola virus adaptation during serial passages in cell culture and infection ofguinea pigs［J］.JInfectDis，2011，204(3): S941－946

6 Wong SK，Lazinski DW.Replicating hepatitis delta virus RNA is edited in the nucleus by the small form of ADAR1［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99(23):15118－15123

7 Shih KN，Chuang YT，Liu H，et al.Hepatitis D virus RNA editing is inhibited by a GFP fusion protein containing a C－terminally deleted delta antigen［J］.The Journal of General Virology，2004，85(4):947－957

8 劉雷，尹鈞.硫氧還蛋白的研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，34 (2):210－218

9 Roos G，F(xiàn)oloppe N，Van Laer K，et al.How thioredoxin dissociates itsmixed disulfide［J］.PLoSComput Biol，2009，5(8):e1000461

10 Carvalho AT，Swart M，van Stralen JN，et al.Mechanism of thioredoxin－catalyzed disulfide reduction.Activation of the buried thiol and role of the variable active－site residues［J］.JPhys Chem B，2008，112(8):2511－2523

11 Bauer H，Massey V，Arscott LD，et al.The mechanism of high Mr thioredoxin reductase from Drosophilamelanogaster［J］.JBiol Chem，2003，278(35):33020－33028

12 黎明，宋馨宇，王曉娟，等.雙順反子翻譯偶聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建及蚓激酶基因F238在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)［J］.微生物學(xué)通報，2011，38(7):1056－1062

13 夏海鋒，張顯，金雄華，等.鎳離子親和層析介質(zhì)的制備及其用于組氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)的純化［J］.江南大學(xué)學(xué)報，2010，9(6):685－689

14 Randolph TW.The two faces of His－tag:Immune response versus ease of protein purification［J］.Biotechnol J，2012，7(1):18－19

15 Medrano G，Dolan MC，Condori J，etal.Quality assessmentof recombinant proteins produced in plants［J］.Methods Mol Biol，2012，82 (4):535－564

16 Fujishima SH，Nonaka H，Uchinomiya SH，et al.Design of a multinuclear Zn(ii)complex asa newmolecular probe for fluorescence imaging of His－tag fused proteins［J］.Chem Commun(Camb)，2011，48(4):594－596

17 張培因，王燕媚，衛(wèi)紅飛，等.金屬螯合親和層析填料的制備及其在重組六聚組氨酸融合蛋白中的應(yīng)用［J］.吉林大學(xué)學(xué)報，2008，34(2):340－342