Folin-Ciocaileu 比色法測定不同產(chǎn)地生姜中總酚

張科衛(wèi)，馬彩霞，繆六舒

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇南京210029)

生姜為姜科植物姜Zingiber OfftcinaleRosc.的新鮮根莖，味辛，性微溫。該植物藥食兩用，同時也是常見的中藥炮制輔料，為歷版《中國藥典》所收載，既可作為調(diào)味品，又具有很好的藥用價值。具有解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳、解魚蟹毒的功能。主要用于風(fēng)寒感冒，胃寒嘔吐，寒痰咳嗽，魚蟹中毒等。

文獻(xiàn)研究表明，生姜的辛辣味主要是其中含有姜辣素類物質(zhì)，該類物質(zhì)是酚的同系物，對鮮姜的化學(xué)成分研究表明，其中除6-姜酚外，還含有4-、7-、8-、10-姜酚，4-、6-、8-、10-、12-姜醇，5-脫氧姜辣素、甲基-6-異姜酚、6-異姜烯酚、6-、8-、10-、12-姜二酮等多種酚類成分［1-3］。

生姜由于具有很好的抗氧化性能，目前在化妝品、食品添加劑、洗滌護膚等方面應(yīng)用廣泛。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，生姜中的姜酚類物質(zhì)具有抗氧化［4］、抗腫瘤［5］、抗神經(jīng)損傷和細(xì)胞保護［6］、抗嘔吐［7］等藥理活性。研究表明，6-姜酚具有抗炎活性，在體內(nèi)、體外試驗中，該化合物均在分子水平顯示出能調(diào)節(jié)相應(yīng)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的作用［8-10］;10-姜酚、8-姜醇、10-姜醇等均具有抑制COX-2的作用［11］。

《中國藥典》2010年版僅測定了生姜中6-姜酚的含有量，對于其它酚類化合物的含有量沒有相應(yīng)的測定方法。國內(nèi)文獻(xiàn)也尚未見有關(guān)生姜中總酚含有量測定的相關(guān)報道。

本實驗建立了生姜中總酚的測定方法，同時對我國不同地域的生姜中總酚量進(jìn)行了測定，一來為生姜的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)，二來也為生姜的合理應(yīng)用提供試驗和理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器島津UV—2401紫外可見分光光度計;Sartorius BP211D型電子天平;TCG—16G臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥沒食子酸對照品(110831-200803，中國藥品生物制品檢定所，供定量測定用);水為二次蒸餾水;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

生姜產(chǎn)地分別為四川西昌、海南?？?、湖南永州、福建永春、江西贛州、浙江臺州、山東信豐、山東沂蒙山、四川德陽、江蘇徐州。以上生姜均為2012年5月收集得到。

2 方法與結(jié)果

2.1 試劑的配制

2.1.1 對照品溶液的制備精密稱取沒食子酸對照品適量，置于50 mL量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.203 mg/mL的對照品貯備液。

2.1.2 供試品溶液的制備取生姜藥材，洗凈，拭干，切成細(xì)末，精密稱取該細(xì)末約20.0 g，加80%乙醇30 mL，浸泡1 h，超聲(工作頻率40 kHz，功率250 W)30 min，離心(4 000 r/min)5 min，取上清液置50 mL量瓶中，殘渣加80%乙醇洗滌兩次，每次5 mL，同前離心，合并上清液，加80%乙醇定容，搖勻。即得。

2.1.3 FoLin-Ciocaileu試劑的制備稱取20.0 g鎢酸鈉和5.0 g鉬酸鈉置于圓底燒瓶中，加140 mL水溶解，加入85%磷酸溶液10 m L和濃鹽酸20 mL，溶解后混勻，文火回流10 h，然后加入3.0 g硫酸鋰及15 mL雙氧水，加熱沸騰15 min至亮黃色，不得帶微藍(lán)和綠色。冷卻，移入250 mL棕色量瓶中，加水定容，搖勻，暗處保存。

2.2 測定波長的選擇精密吸取對照品溶液和供試品溶液各0.1 mL，分別加80%乙醇0.4 mL，加3 mL水，加10%福氏試劑2.5 mL，加7.5%碳酸鈉2.0 m L，加水2.0 mL，混勻，45℃水浴40 min，取出，搖勻，室溫放置10 min后，于400～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為765 nm，見圖1。

圖1 對照品(沒食子酸)(A)和樣品(四川西昌生姜總酚)(B)的紫外光譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取對照品貯備液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別加80%乙醇0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.0 mL，加3 mL水，加10%福氏試劑2.5 mL，加7.5%碳酸鈉2.0 mL，加蒸餾水2.0 mL，混勻，45℃水浴40 min，取出，搖勻，室溫放置10 min后，765 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為Y=0.080 9X+0.079 8，r=0.999 9。線性范圍為2.03～10.15 μg/mL。

2.4 精密度試驗取質(zhì)量濃度為6.09 μg/mL的對照品溶液，重復(fù)測定6次，記錄其吸光度的值，RSD為0.14%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗精密吸取新鮮配制的生姜供試品(四川西昌)溶液0.1 mL置于10 mL的棕色具塞試管中，照2.2項下操作，分別于0、0.5、1、1.5、2 h測定其吸光度，RSD為0.34%，結(jié)果表明本法所測樣品在2 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗取產(chǎn)自四川西昌的生姜藥材，洗凈，拭干，切成細(xì)末，分別精密稱取該細(xì)末約20.0 g，平行6份。分別制成供試品溶液，照2.2項下操作，結(jié)果其中所含總酚的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.080%，RSD為0.64%，結(jié)果表明所測樣品的重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗取沒食子酸對照品適量，加80%乙醇溶解，配成質(zhì)量濃度為0.805 4 mg/mL的溶液，作為加樣對照品貯備液。取產(chǎn)自四川西昌的生姜藥材，洗凈，拭干，切成細(xì)末，精密稱取該細(xì)末約10.0 g，平行6份，精密加入加樣對照品貯備液10.0 mL，加80%乙醇20 mL，照2.1.2項下操作，測定吸光度的值并計算回收率，得平均回收率為100.53%，RSD為1.07%。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果

2.8 樣品的測定取各產(chǎn)地的生姜藥材，洗凈，拭干，切成細(xì)末，各精密稱取約20.0 g，每個產(chǎn)地平行3份，按供試品溶液制備方法制備。精密吸取上述各供試品溶液0.1 mL置10 mL的棕色具塞試管中，照2.2項下操作，測定吸光度的值，每份平行測定兩次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其中總酚的含有量。結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地的生姜所含總酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=6)

3 結(jié)論

3.1 我國為生姜生產(chǎn)大國，每年有大量的生姜出口，山東、四川、湖南、江西、福建、江蘇、浙江等省為生姜的種植大省。本課題組根據(jù)我國的生姜種植情況，共收集了10個產(chǎn)地的生姜:山東信豐、山東沂蒙山、四川西昌、四川德陽、湖南永州、江西贛州、福建永春、浙江臺州、江蘇徐州、海南?？凇＿@些生姜都是當(dāng)?shù)剞r(nóng)家種植的有機生姜，由于生姜采收期為每年的9、10月份，剛采收上來的姜稱為“嫩姜”，我們收集的時候已經(jīng)是次年的5月份，這個時候是“老姜”，也就是我們平時見到的生姜。這些都是從當(dāng)?shù)剞r(nóng)民家的地窖里取出來的。從外形看，除山東和徐州的生姜個頭較大外，其它產(chǎn)地的生姜個頭都比較小，也就是我們常說的“本生姜”。

3.2 本實驗對從全國不同地區(qū)收集來的生姜進(jìn)行了總酚量的測定，結(jié)果表明，全國不同地區(qū)的生姜中總酚類成分量存在較大差異，最高的為海南?？诋a(chǎn)的生姜，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)0.108%;最低的為山東信豐和江蘇徐州產(chǎn)的生姜，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.054%，僅為海南?？诋a(chǎn)生生姜的1/2。推測可能與生姜的生長環(huán)境及氣候等因素有關(guān)。

3.3 在實驗過程中，我們參考相關(guān)文獻(xiàn)［12-13］，考察了試劑的用量、反應(yīng)的溫度及時間等因素對顯色穩(wěn)定性的影響。

3.3.1 由于生姜中的姜酚類物質(zhì)水溶性比較差，因此在選擇提取溶劑時，我們考察了50%、60%、80%的乙醇作為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)，采用80%乙醇為溶劑，超聲30 min所得的溶液顯色后測定結(jié)果較穩(wěn)定。

3.3.2 由于實驗過程中使用的試劑如福氏試劑、碳酸鈉等均為水溶性試劑，在高濃度的乙醇溶液中會結(jié)晶析出，影響最終顯色反應(yīng)后溶液的澄明度，經(jīng)多次實驗最終確定了“加10%福氏試劑2.5 mL，加7.5%碳酸鈉2.0 mL，加水2.0 mL”，在這樣的試劑比例下，顯色溶液的澄明度和穩(wěn)定性都較高。

3.3.3 在考察反應(yīng)溫度和時間的實驗時，我們發(fā)現(xiàn)，使用45℃的水浴40 min反應(yīng)條件比較溫和，在該條件下，顯色穩(wěn)定，靈敏度高，結(jié)果可靠。

綜合以上預(yù)試驗結(jié)果，本實驗最終確定了0.1 mL供試品溶液加80%乙醇0.4 mL，加3 mL水，加10%福氏試劑2.5 mL，加7.5%碳酸鈉2.0 m L，加水2.0 mL，混勻，45℃水浴40 min，取出，搖勻，室溫放置10 min后，于765 nm處測定含有量的方法。

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