基于HPLC指紋圖譜及多指標(biāo)成分對(duì)黃柏飲片的等級(jí)研究

高源，胡昌江，吳珊珊，李文兵，周一帆

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都611137)

黃柏為蕓香科植物黃皮樹(shù)Phellodendron chineseSchneid.的干燥樹(shù)皮，習(xí)稱“川黃柏”［1］。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有性味苦、寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效［2］，其后歷代本草均有記載［3-4］。黃柏中的主要活性部位為生物堿類化合物，包括鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿和鹽酸黃柏堿等主要成分［5］。黃柏飲片為傳統(tǒng)中藥，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床和中成藥生產(chǎn)，因此在流通市場(chǎng)上是否按著優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)的方式管理黃柏飲片，直接影響到臨床療效和中醫(yī)藥的發(fā)展。由此看來(lái)對(duì)黃柏飲片分級(jí)的研究勢(shì)在必行［6］。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前絕大部分中藥材飲片市場(chǎng)和企業(yè)都是以產(chǎn)地和生長(zhǎng)年限(樹(shù)皮厚度)作為價(jià)格定制和質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)，把黃柏飲片分為一等和統(tǒng)貨。一等為10年以上道地產(chǎn)區(qū)(滎經(jīng))，且刮凈粗栓皮，無(wú)枝皮的黃柏飲片;統(tǒng)貨為其他產(chǎn)區(qū)黃柏及10年以下，間有枝皮的滎經(jīng)黃柏。一等黃柏飲片價(jià)格明顯高于統(tǒng)貨。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜(HPLC)法，按照中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)［7］，對(duì)不同等級(jí)黃柏飲片進(jìn)行指紋圖譜相似度分析、聚類分析［8］和多指標(biāo)成分分析［9］，從而驗(yàn)證該方法的合理性和科學(xué)性。為規(guī)范黃柏飲片質(zhì)量和市場(chǎng)管理提供依據(jù)。

1 儀器、試劑與試藥

美國(guó)Aglient 1200高效液相色譜儀(含G1312B二元泵，G1315C型DAD檢測(cè)器);KQ-300E超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BP-61電子天平(感量0.0001g，德國(guó)Sartorius公司)。

鹽酸小檗堿(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110713—200911)、鹽酸黃柏堿(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)為MUST-12021407);鹽酸藥根堿(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)為MUST-10122001);鹽酸巴馬汀(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)為MUST-11122703)。

水為超純水;乙腈為色譜純;其他為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品收集與前處理實(shí)驗(yàn)收集了2個(gè)等級(jí)18批黃柏藥材，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為黃皮樹(shù)Phellodendron chinenseSchneid.的干燥樹(shù)皮，見(jiàn)表1。藥材按照《中國(guó)藥典》［1］要求切成黃柏絲，經(jīng)曬干后，置陰涼干燥處儲(chǔ)藏，實(shí)驗(yàn)前在40℃［10］的烘箱中烘30 min，粉碎，過(guò)三號(hào)篩，備用。

表1 18批黃柏樣品來(lái)源Tab.1 Resourcres of 18 batches of Phellodendri chinensis Cortex pieces

2.2 HPLC指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm;柱溫為30℃;體積流量為1 mL/min;進(jìn)量樣為5 μL;流動(dòng)相為乙睛(A)-1.04 mol/LNH4Cl水溶液［11］(B)梯度洗脫，0～6 min(12%～18%A)，6～10 min(18%～20%A)，10～15 min(20%～20%A)，15～25 min(20%～25%A)，25～35 min(25%～40%A)，35～50 min(40%～55%A)。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備精密稱取適量鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿4個(gè)對(duì)照品溶于甲醇配成混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備精密稱取18批黃柏樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.5 g，置250 mL具塞錐形瓶中，精密量取1%鹽酸-甲醇20 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)40 min，取出，放冷，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，進(jìn)樣前用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液即為18個(gè)供試品溶液，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)精密稱取黃柏樣品S1，根據(jù)2.2.3項(xiàng)下制備樣品供試液，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明10個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積基本一致，相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3.0%和相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%，符合指紋圖譜要求，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取5份黃柏樣品S1，按照2.2.3項(xiàng)下制備樣品供試液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明10個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積基本一致，相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3.0%和相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%，符合指紋圖譜要求，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取黃柏樣品S1，按照2.2.3項(xiàng)下制備樣品供試液，分別按上述色譜條件在0、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄指紋圖譜。結(jié)果10個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于3.0%和相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%，符合指紋圖譜要求，表明樣品供試液指紋圖譜在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.4 指紋圖譜的測(cè)定將混合對(duì)照品溶液和18批黃柏樣品的供試品溶液按照2.2.1項(xiàng)，進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄各色譜指紋圖譜。按照中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)［7］對(duì)18批黃柏樣品色譜圖進(jìn)行分析，確定10個(gè)共有峰，見(jiàn)圖1、圖2。2號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)峰與混合對(duì)照品對(duì)照分別鑒定為鹽酸黃柏堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿。以9號(hào)峰(S)鹽酸小檗堿作為參照峰，記為S。見(jiàn)圖1～3。

圖1 混合對(duì)照品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of the m ixed reference substances

2.5 相似度計(jì)算與評(píng)價(jià)采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)(國(guó)家藥典委員會(huì))，建立共有模式作為對(duì)照指紋圖譜(見(jiàn)圖3)，將18批黃柏樣品圖譜與對(duì)照指紋圖譜比較，計(jì)算各黃柏樣品中共有峰的峰面積值和相似度，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

圖2 18批黃柏飲片HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of 18 batches of Phellodendri Chinensis Cortex pieces

圖3 對(duì)照指紋圖譜Fig.3 Reference fingerprint

表2 18批黃柏飲片指紋圖譜主要共有峰峰面積結(jié)果Tab.2 Results of the peak areas of m ainly common peaks on HPLC fingerprints of 18 batches of Phellodendri chinensis Cortex pieces

表3 18批黃柏飲片指紋圖譜與參照?qǐng)D譜的相似度結(jié)果Tab.3 Sim ilarity results of HPLC fingerprints and reference chromatogram on 18 batches of Phellodendri Chinensis Cortex pieces

表3結(jié)果顯示相似度均大于0.997，其中S1、S2、S3、S4、S5、S6、S13號(hào)樣品相似度為1。

2.6 聚類分析以黃柏樣品10個(gè)共有峰的峰面積值(表2)為聚類指標(biāo)，運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)18批樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4顯示，當(dāng)距離標(biāo)尺在9時(shí)，14批黃柏飲片聚為兩類，第1類為樣品S1～S6，第2類為樣品S7～S18。

圖4 18批黃柏飲片HPLC指紋圖譜聚類分析圖Fig.4 Clustering analysis chart HPLC fingerprints of 18 batches of Phellodendri chinensis Cortex pieces

2.7 4個(gè)指標(biāo)成分峰面積值分析以批次為橫坐標(biāo)，以表1中鹽酸黃柏堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿4個(gè)色譜峰峰面積總值為縱坐標(biāo)，得出18批黃柏4個(gè)共有峰峰面積總值折線圖，見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示一等(S1～S6)4個(gè)共有峰峰面積總值均在4 300以上，統(tǒng)貨(S7～S18)均在4 300以下。

3 結(jié)論

圖5 18批黃柏飲片中鹽酸黃柏堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿峰面積總值折線圖Fig.5 Line graph of peak area values totally on phellodendrine hydrochloride、palmatine hydrochloride、jatrorrhizine hydrochloride、berberine hydrochloride of 18 batches of Phellodendri chinensis Cortex pieces

相似度分析結(jié)果表明各批次黃柏指紋圖譜整體圖貌基本一致，區(qū)別在于各成分含量不同。聚類分析結(jié)果表明，18批黃柏飲片明顯聚為2類。分析4個(gè)指標(biāo)成分峰面積總值結(jié)果得出，不同產(chǎn)區(qū)黃柏中峰面積總值差異較大，一等黃柏飲片中峰面積總值明顯大于二等，這與聚類分析結(jié)果一致。綜上所述，一等黃柏飲片和二等差別明顯，且一等質(zhì)量明顯優(yōu)于二等，從而證明了傳統(tǒng)黃柏飲片分級(jí)方法的合理性與科學(xué)性。這為黃柏等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的建立和按質(zhì)論價(jià)管理提供一定依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合現(xiàn)代分析技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地黃柏飲片內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行研究，各產(chǎn)區(qū)成分含有量差異較大，其中滎經(jīng)黃柏各成分含有量明顯高于其他產(chǎn)地，證實(shí)了滎經(jīng)黃柏的道地性，可能與滎經(jīng)獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候有關(guān)，形成了滎經(jīng)黃柏“肉厚色深”優(yōu)良品質(zhì)［12］。

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