HPLC法同時測定麥味地黃膠囊中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚

馮發(fā)青，王恩源，伍慶，龍風(fēng)榮，柳立偉，洪江

(1.貴州師范大學(xué)，貴州貴陽550001;2.貴州弘康藥業(yè)有限公司，貴州貴陽550001;3.貴州科學(xué)院，貴州貴陽550001)

麥味地黃膠囊處方出自明代經(jīng)典醫(yī)籍《體仁匯編》，是在麥味地黃丸基礎(chǔ)上進(jìn)行改劑而成。其方中山茱萸具有補(bǔ)益肝腎，澀精固脫之功效，馬錢苷為其主要有效成分之一，牡丹皮具有清熱涼血，活血化瘀的功效，主要有效成分為丹皮酚和芍藥苷［1］?！吨袊幍洹?010年版一部以馬錢苷和丹皮酚為麥味地黃丸的質(zhì)量控制指標(biāo)［2］，前人也對此類中成藥中馬錢苷或丹皮酚的含有量測定方法進(jìn)行了研究［3-7］，但對方中芍藥苷含有量測定方法研究較少。本實驗選擇馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚為研究對象，在參照文獻(xiàn)基礎(chǔ)上［8-13］，建立了一種同時測定麥味地黃膠囊中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚的方法，該方法準(zhǔn)確可靠，為更好地控制麥味地黃膠囊成品質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent色譜工作站(安捷倫科技有限公司);CH—250超聲波清洗儀(北京創(chuàng)新德超聲電子研究所);AL—204電子天平［梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］。

1.2 試藥馬錢苷對照品(批號111640-200604)、芍藥苷對照品(批號110736-200629);丹皮酚對照品(批號110708-200506)為中國藥品生物制品檢定所提供;麥味地黃膠囊為市售(批號:20111101，20111201，20111202，貴州弘康藥業(yè)有限公司);缺山茱萸、牡丹皮陰性樣品(自制);乙腈為色譜純，水為超純水(自制)，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～28 min，8%A～19%A;28～38 min，19%A～26%A;38～65 min，26%A～50%A);體積流量:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:235 nm。進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備分別精密稱取馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚對照品適量，加甲醇適量溶解并定量稀釋制成含馬錢苷0.522 1 mg/mL、芍藥苷0.453 8 mg/mL和丹皮酚1.029 mg/mL的混合對照品貯備液，備用。精密吸取上述貯備液1 mL于10 mL量瓶中，甲醇定容，制得含馬錢苷52.21 μg/mL、芍藥苷45.38 μg/mL和丹皮酚0.102 9 mg/mL的混合對照品溶液。供定量測定用。

2.2.2 供試品溶液的制備取麥味地黃膠囊內(nèi)容物約1.0 g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，加50%甲醇20.00 mL，密塞，稱定質(zhì)量;超聲提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，常壓過濾，取續(xù)濾液過0.45 μm濾膜，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液的制備按處方比例分別制備缺山茱萸、牡丹皮藥材的陰性樣品，按2.2.2項下方法制備陰性供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液分別注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚的理論塔板數(shù)均不低于10 000，各峰分離度均達(dá)1.5，且陰性對照無干擾。對照品、樣品與陰性樣品的色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)、樣品(B)、缺牡丹皮陰性樣品(C)、缺山茱萸陰性樣品(D)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substances(A)，sam ple(B)，negative samp le w ithout Corni Fructus(C)and negative samp le w ithout Moutan Cortex(D)

2.4 線性關(guān)系的考察分別精密量取上述混合對照品貯備液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。按2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。以各對照品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為:馬錢苷Y=1 254.3X+49.359(r=0.999 8)，芍藥苷Y=1 585.7X+17.172(r=0.999 7)，丹皮酚Y=3 447.2X－73.445(r=0.999 9)，結(jié)果表明馬錢苷在0.209～1.253 μg，芍藥苷在0.182～1.089 μg，丹皮酚在0.412～2.470 μg范圍內(nèi)，其含有量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗精密吸取同一混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，按峰面積計算RSD值。馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚的RSD分別為0.4%、0.5%和0.3%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。2.6穩(wěn)定性試驗取批號為20111201樣品，按2.2.2項下制備供試品溶液，室溫放置，按2.1項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積，結(jié)果馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚峰面積RSD分別為0.2%、1.1%和0.3%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗取批號為20111201樣品，按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，計算得馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.1%、1.2%和0.5%，表明該方法重復(fù)性好。

2.8 回收率試驗取批號為20111201麥味地黃膠囊內(nèi)容物9份(3份1組)，每份約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，各組分別按樣品中各成分量的80%、100%、120%加入對照品，按2.2.2項下的方法操作制備供試品溶液，按2.1項下方法進(jìn)行測定，計算回收率。結(jié)果馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的平均回收率分別為98.22%、97.88%、99.10%，RSD分別為1.14%、0.90%、1.37%，見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)Tab.1 Results of recovery(n=9)

2.9 樣品測定取3批樣品(批號20111101、20111201、20111202)，每批3份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件對3批樣品進(jìn)行測定，記錄峰面積，外標(biāo)法計算，測定結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Content determ ination of samp les(n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇經(jīng)紫外可見分光光度計掃描，馬錢苷在235 nm處有最大吸收峰，芍藥苷在230 nm處有最大吸收峰，丹皮酚在230 nm、274 nm處均有吸收峰。通過實驗考察在波長為235 nm時馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚均有較好的響應(yīng)，所以本實驗選擇檢測波長為235 nm。

3.2 流動相的選擇《中國藥典》2010年版一部中麥味地黃丸有關(guān)馬錢苷的測定以含有四氫呋喃為流動相，而四氫呋喃對反相色譜系統(tǒng)的柱塞密封圈有一定的腐蝕性，故本實驗考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等流動相體系。發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸水溶液流動相體系中進(jìn)行梯度洗脫時，其分離度、理論塔板數(shù)、峰的對稱性及出峰時間均達(dá)到滿意的結(jié)果，且可與芍藥苷、丹皮酚在同一流動相體系中進(jìn)行同時測定。

3.3 提取溶劑和方法的選擇由于芍藥苷、馬錢苷易溶于水，丹皮酚易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，故實驗比較了甲醇，乙醇，及80%、50%、20%甲醇5種提取溶劑，并考察了超聲和加熱回流兩種提取方法，以及提取時間和溶劑體積等，試驗結(jié)果表明加入20 mL 50%甲醇溶液超聲提取1 h的條件下各指標(biāo)成分提取完全、方法簡便，提取效果較好。

3.4 結(jié)論通過提取條件的優(yōu)化、色譜條件的選擇及系統(tǒng)性試驗的考察，說明該方法快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以為提高麥味地黃膠囊的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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