貞芪酪蛋白肽復(fù)合物對(duì)Lew is肺癌荷瘤小鼠抗瘤作用及對(duì)IL-2、TNF的影響

吳建軍，金玉，張延英，劉潤，李海龍，吳紅彥，李應(yīng)東，劉凱

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000;2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，甘肅蘭州730000)

國外酪蛋白多肽在保健品、醫(yī)藥等多領(lǐng)域廣泛使用。酪蛋白是乳中含量最高的蛋白質(zhì)，目前主要作為食品原料或微生物培養(yǎng)基使用，利用蛋白質(zhì)酶促水解技術(shù)制得的酪蛋白磷酸肽具有防止礦物質(zhì)流失、預(yù)防齲齒，防治骨質(zhì)疏松與佝僂病，調(diào)節(jié)血壓，治療缺鐵性貧血、缺鎂性神經(jīng)炎等多種生理功效［1－2］。貞芪酪蛋白肽是根據(jù)祖國醫(yī)學(xué)“扶正培本、扶正驅(qū)邪”的理論，以黃芪、女貞子及酪蛋白按照一定比例的復(fù)合多肽組方，經(jīng)特定制劑工藝研制而成的。貞芪酪蛋白肽復(fù)合物藥物血清具有對(duì)肝癌肺癌等腫瘤細(xì)胞的抑制作用［3－4］，具有提高大鼠機(jī)體的免疫力，保護(hù)骨髓和腎上腺皮質(zhì)功能的作用［5－6］。貞芪酪蛋白肽復(fù)合物在體抗腫瘤及對(duì)荷瘤鼠血清細(xì)胞因子調(diào)節(jié)作用需要進(jìn)一步明確，白細(xì)胞介素－2(interleukin－2，IL－2)是T細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子－α(Tumor Necrosis Factor，TNF)是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子［7］。本研究利用Lewis肺癌荷瘤鼠模型對(duì)貞芪酪蛋白肽復(fù)合物抗腫瘤進(jìn)行研究，并試圖從體內(nèi)揭示貞芪酪蛋白肽復(fù)合物對(duì)荷瘤鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型與瘤株SPF級(jí)8周齡昆明種小鼠72只，雌性，體質(zhì)量18～24 g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，選用培養(yǎng)的Lewis肺癌細(xì)胞，按1∶3比例制成瘤細(xì)胞懸液，常規(guī)接種在小鼠右前肢腋窩下，每只接種0.2 mL(瘤細(xì)胞數(shù)量為106個(gè)/mL)。Lewis肺癌由中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供，甘肅中醫(yī)學(xué)院長期移植傳代。

1.2 藥物配制與試劑貞芪酪蛋白復(fù)合肽，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研中心制備，為棕褐色顆粒狀。α腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor－α，TNF－α)、白細(xì)胞介素2(Interleukin－2，IL－2)多重抗體試劑購于美國BD公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 給藥方法與分組將72只小鼠除隨機(jī)抽取12只作為陰性對(duì)照組之外，其余接種后24 h移植瘤小鼠隨機(jī)分為5組，分別模型組，陽性對(duì)照組，貞芪酪蛋白肽復(fù)合物1.5、3.1、3.5 g/kg 3個(gè)劑量組，陽性藥物采用金復(fù)康口服液(江中集團(tuán)一村制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)101208，給藥劑量0.1 mL/10 g);連續(xù)灌胃給藥10 d，第11天小鼠眼球放血后脫頸處死，2 000 r/min離心制備小鼠血清，利用美國BD公司液相多重檢測細(xì)胞因子過程說明在流式細(xì)胞儀上對(duì)IL－2和TNF進(jìn)行檢測，剝離并摘除荷瘤鼠實(shí)體瘤、胸腺及脾臟稱質(zhì)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法瘤質(zhì)量、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及IL－2和TNF計(jì)量資料用±s表示，服從正態(tài)分布采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用q檢驗(yàn)，對(duì)計(jì)量資料不服從正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn);所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件分析，用P≤0.05做為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

抑制率(%)=［(模型對(duì)照組瘤質(zhì)量－實(shí)驗(yàn)組瘤質(zhì)量)/模型對(duì)照組瘤質(zhì)量］×100%

2 結(jié)果

2.1 對(duì)荷瘤小鼠實(shí)體瘤瘤質(zhì)量的影響給藥10 d后處死小鼠剝離實(shí)體瘤，對(duì)實(shí)體瘤采用同樣方法剝離，剝離后瘤質(zhì)量馬上稱質(zhì)量，貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物高劑量組瘤質(zhì)量與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)荷瘤鼠瘤質(zhì)量的影響Tab.1 Effects of Zhenqi Casein Peptide Complexes on the tumor-bearing m ice tumor weight

2.2 對(duì)荷瘤鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物高、中劑量組荷瘤小鼠胸腺指數(shù)與模型組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物高劑量組荷瘤小鼠脾臟指數(shù)與模型組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，中、低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果見圖1。

2.3 對(duì)荷瘤鼠細(xì)胞因子IL－2、TNF的影響貞芪酪蛋白各劑量組荷瘤小鼠血清IL－2、TNF水平呈劑量依賴性升高，貞芪酪蛋白高、中劑量組荷瘤小鼠血清IL－2水平與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，貞芪酪蛋白高劑量組荷瘤小鼠血清TNF水平與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果見表2。

圖1 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響Fig.1 Effects of Zhenqi Casein Peptide Com plexes on the tumor-bearing m ice thymus index and spleen index

表2 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)荷瘤小鼠血清IL-2，TNF的影響Tab.2 Effects of Zhenqi Casein Peptide Complexes on the tumor-bearing m ice serum IL-2 and TNF

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移是由于臟腑機(jī)能減退，陰陽氣血失調(diào)，正氣虧虛所致。腫瘤的發(fā)病原因比較復(fù)雜，早期的預(yù)防對(duì)腫瘤的防治極其重要，但現(xiàn)實(shí)是腫瘤病人大多會(huì)由于發(fā)現(xiàn)遲而失去手術(shù)根除的機(jī)會(huì)，所以對(duì)中、晚期腫瘤病人以提高病人的生存質(zhì)量、延長存活時(shí)間作為臨床的主要選擇。目前，中西醫(yī)治療腫瘤是未來發(fā)展的主要方向，中藥方劑治療疾病的作用通常是多靶點(diǎn)、多途徑、多層次的整體水平的調(diào)節(jié)作用，從整體上“扶正驅(qū)邪”，回復(fù)“正氣”，提高人的抗病能力，達(dá)到“正氣在內(nèi)，邪不可干”的治療效果。貞芪酪蛋白復(fù)合物是根據(jù)祖國醫(yī)學(xué)“扶正培本、扶正驅(qū)邪”的理論研制而成，黃芪為補(bǔ)氣升陽藥物，具有很多功效，黃芪能增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的活性，能促進(jìn)T細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)釋放免疫活性物質(zhì)如干擾素、白細(xì)胞介素等［8－9］;女貞子有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效，女貞子也是目前抗衰老、抗腫瘤方劑中的主要藥物之一［10－11］。酪蛋白多肽(Casein peptides)能促進(jìn)機(jī)體對(duì)微量元素的高效吸收，并調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能［12－13］。IL－2是T細(xì)胞和NK細(xì)胞發(fā)揮作用參與免疫反應(yīng)的關(guān)鍵參與者，同樣IL－2水平的升高是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)［14－15］。TNF是促進(jìn)炎性反應(yīng)的重要物質(zhì)［16］，TNF能夠有效的促進(jìn)腫瘤組織壞死，其機(jī)理可能與T細(xì)胞參與的細(xì)胞凋亡有關(guān)［17］。文獻(xiàn)報(bào)道的扶正抗瘤方與化療藥物合用具有增效減毒作用，主要通過提高機(jī)體免疫力，改善化療藥物對(duì)機(jī)體的損傷功效［18］。本研究顯示，高劑量貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物能明顯抑制腫瘤生長，提示貞芪酪蛋白肽的抗腫瘤作用，貞芪酪蛋白復(fù)合物還能夠調(diào)節(jié)血清IL－2和TNF水平，說明調(diào)節(jié)免疫功能是其抗腫瘤作用機(jī)制的途徑之一。

［1］Kunz C，L?nnerdal B.Human－milk proteins:analysis of casein and casein subunits by anion－exchange chromatography，gel electrophoresis，and specific staining methods［J］.Am J Clin Nutr，1990，51(1):37－46.

［2］Kim Y，Atalla H，Mallard B，et al.Changes in Holstein cow milk and serum proteins during intramammary infection with three different strains ofStaphylococcus aureus［J］.BMC Vet Res，2011，7－51.

［3］張延英，朱建坤，吳建軍，等.貞芪酪蛋白肽藥物血清誘導(dǎo)Bel－7402細(xì)胞分化的體外實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14(9)47－49.

［4］張延英，吳建軍，王鵬善，等.貞芪酪蛋白肽復(fù)合物血清對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞分化抑制作用及相關(guān)機(jī)制研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(4):114－117.

［5］汪永鋒，張延英，李廣遠(yuǎn)，等.貞芪酪蛋自復(fù)合肽對(duì)人鼠巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用［J］.中醫(yī)研究，2007，19(3):22－24.

［6］江永鋒，張延英，李廣遠(yuǎn)，等.貞芪酪蛋白復(fù)合肽對(duì)免疫低下小鼠免疫調(diào)節(jié)的影響［J］.衛(wèi)生職業(yè)教育，2006，24(8)135－136.

［7］Singh S，Singh U，Pandey S S.Serum concentration of IL－6，IL－2，TNF－α，and IFN－γ in Vitiligo patients［J］.Indian J Dermatol，2012，57(1):12－4.

［8］高麗娜，李麗.黃芪調(diào)節(jié)免疫功能的應(yīng)用研究［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24(6):25－28.

［9］孫延濤，孫琦.黃芪的藥理作用研究［J］.黑龍江醫(yī)藥，2007，20(3):256－259.

［10］張興輝，石力夫.中藥女貞子化學(xué)成分的研究［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25(3):333－334.

［11］曹靜，王淑華.女貞子不同劑量的藥理作用及臨床應(yīng)用［J］.首都醫(yī)藥，2002，9(12):35.

［12］Noh J，Lee J H，Noh G，et al.Characterisation of allergen－spe－cific responses of IL－10－producing regulatory B cells(Br1)in cow milk allergy［J］.Cell Immunol，2010，264(2):143－9.

［13］Politis I，Chronopoulou R.Milk peptides and immune response in the neonate［J］.Adv Exp Med Biol，2008，606:253－69.

［14］Lin J X，Spolski R，Leonard W J.Critical role for Rsk2 in T－lymphocyte activation［J］.Blood，2008，111(2):525－533

［15］Zambricki E，Shigeoka A，Kishimoto H，et al.Signaling T－cell survival and death by IL－2 and IL－15［J］.Am J Transplant，2005，5(11):2623－2631.

［16］Sanchez－M?noz F，Dominguez－Lopez A，Yamamoto－Furusho J K.Role of cytokines in inflammatory boweldisease［J］.World J Gastroenterology，2008，14(27):4280－4288.

［17］Atreya R，Zimmer M，Bartsch B，et al，Antibodies against tumor necrosis factor(TNF)induce T－cell apaotosis in patients with inflammatory bowel diseases via TNF receptor 2 and intestinal CD14+macrophages［J］.Gastroenterology，2011，141(6):1026－1038.

［18］焦河玲，鄧虹珠，王曉娟，等.扶正抗瘤方的輔助抗腫瘤研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(4):162－164.