乳酸桿菌S-層蛋白研究進(jìn)展

北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司

飼用微生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 王 凡 李曉清 劉 婷 王安如＊

大量研究證實(shí)乳酸桿菌制劑對(duì)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗病力、調(diào)節(jié)免疫機(jī)能等方面均有較好的作用效果。乳酸桿菌與宿主細(xì)胞的黏附是乳酸菌發(fā)揮生理作用的基礎(chǔ)，通過(guò)黏附于腸上皮細(xì)胞表面，定植形成穩(wěn)定的菌群，抑制病原菌對(duì)宿主的定植、移位和感染，維護(hù)腸黏膜的完整性，保護(hù)宿主腸道上皮細(xì)胞免受侵襲，而且黏附于腸道的益生菌可起到免疫調(diào)節(jié)作用，維持腸道健康高效的生理功能。

細(xì)菌的黏附可分為特異性黏附和非特異性黏附（Ofek等，1994）。特異性黏附是通過(guò)細(xì)菌與黏膜上皮細(xì)胞受體的結(jié)合；非特異性黏附則是通過(guò)疏水、靜電等進(jìn)行作用。早期的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌細(xì)胞壁中的脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）和細(xì)胞外多糖（EPS）參與了乳酸桿菌和宿主細(xì)胞之間的黏附，其中LTA起主要作用 （Granato等，1999），近年來(lái)的研究多集中在乳酸桿菌中介導(dǎo)黏附的表面蛋白（Rinkinen等，2003）。其中研究較為清楚的是 S-層蛋白（S-layer protein，SLP），目前普遍認(rèn)為S-層蛋白是乳酸菌的黏附素之一，本文就乳酸桿菌S層蛋白的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能、應(yīng)用等方面作一綜述。

1 乳酸菌S-層蛋白的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

S-層蛋白廣泛存在于古細(xì)菌和真細(xì)菌表面，是由蛋白質(zhì)組成的晶格狀結(jié)構(gòu)，位于細(xì)胞壁或細(xì)胞膜外層，其中乳酸菌S-層蛋白分子質(zhì)量為40～71 kDa，是目前已知分子質(zhì)量最小的S-層蛋白，占菌體總蛋白的10%～15%，一般疏水性氨基酸占31.9%～38.7%，含有大量谷氨酸和天冬氨酸（15%），賴氨酸含量也相當(dāng)高（10%），極少存在含硫氨基酸 （孫明等，2002；Sara和Sleytr，2000）。 高等電點(diǎn)（PI為 9.35 ～ 10.4）是乳酸菌 S-層蛋白的最大特征（Sleytr 和 Sára，1997；Bro..ckl等，1991）。乳酸桿菌S-層蛋白的同源性主要集中于C端，該區(qū)域主要負(fù)責(zé)蛋白對(duì)細(xì)胞外膜的錨定作用，而N端的區(qū)域主要與蛋白的自身組裝及對(duì)細(xì)胞的黏附作用相關(guān)，變異較大（Sára等，1994）。S-層蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，20%的氨基酸構(gòu)成α-螺旋，40%為β-折疊，β-轉(zhuǎn)角與非周期性折疊為5%～45%。許多古菌和G+細(xì)菌的S-層蛋白被糖基化，可與糖鏈共價(jià)結(jié)合，在有些S-層蛋白中還有磷酸化修飾作用（Schaffer 和 Graninger2001；Messner 等 ，1997）。乳酸菌中只有布氏乳桿菌（L.buchneri）發(fā)現(xiàn)具有多聚糖結(jié)構(gòu)（Fogh等，1997）。但是大多數(shù)乳桿菌S-層蛋白未發(fā)現(xiàn)類似結(jié)構(gòu) （Darfeuille-Michand等，1990）。目前，研究表明，S-層蛋白存在于許多乳桿菌中，如短乳桿菌（L.brevis）、瑞士乳桿菌（L.helveticus）、嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、卷曲乳桿菌（L.crispatus）和（L.gallinarum）等，而約氏乳桿菌（L.johnsonii）和格氏乳桿菌（L.gaserri）等被稱為B群嗜酸乳桿菌的一類乳酸菌并不含有S-層蛋白 （Hagen 等，2005，Boot等 1996b；Boot等，1996a）。

2 乳酸菌S-層蛋白基因

目前，只有少數(shù)乳酸桿菌的S-層蛋白基因被克隆并測(cè)序，如短乳桿菌 （L.brevis）（Vidgren等，1992）、 嗜酸乳桿菌 （L.acidophilus）（Boot和Kolen，1993）、 瑞士乳桿菌 （L.helveticus）（Callegari等，1998）和卷曲乳桿菌（L.crispatus）（Sillanp a..a..等，2000）等。一些乳酸桿菌的SLP基因已被收錄在 GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中。有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌中普遍存在多個(gè)S-層蛋白基因，如短乳桿菌（L.brevis）ATCC 14869就含有 3個(gè) S-層蛋白基因：slpB、slpC 和 slpD（Vidgren等，1992）。 嗜酸菌乳桿菌都具有兩個(gè)S-層蛋白基因，如嗜酸乳桿菌 （L.cripatus）ATCC 4356 和 卷 曲 乳 桿 菌 （L.crispatus）JCM 5810，其中一個(gè)基因可在細(xì)菌中得到表達(dá)，而另一個(gè)則為沉默型 （Boot等，1996b；Boot等，1995；Boot和 Kolen，1993）。 陳雪燕（2007）利用 RT-PCR、Western blot 和 ELISA等技術(shù)對(duì)卷曲乳桿菌 （L.crispatus）ZJ001的研究也表明，該菌含有兩個(gè)S-層蛋白基因，slpA與slpB基因，slpB為沉默基因。同時(shí)，不同的乳酸菌具有不同的S-層蛋白基因結(jié)構(gòu)。嗜酸乳桿菌（L.cripatus）ATCC 4356中的兩個(gè)slp基因間隔3 kb，并且在slp基因片段中處于相對(duì)的位置（Avall-Ja..a..skela..inen 等，2002）；短乳桿菌（L.brevis）ATCC 14869中的 slpB與 slpC相鄰，而離slpD 較遠(yuǎn)（Jakava-viljanen 等 ，2002）；卷曲乳桿菌 （L.crispatus）ZJ001的 S-層蛋白基因 slpA和slpB位于長(zhǎng)約9.0 kb的slp片段上，間隔約4.5 kb。

嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、卷曲乳桿菌（L.crispatus）和瑞士乳桿菌（L.helveticus）的 slp 在 C端區(qū)域有著高度的相似性，而在N端區(qū)域變化很大（Sillanpa..a..等，2000）。 然而，嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）和瑞士乳桿菌（L.helveticus）的 slp 在整個(gè)序列都表現(xiàn)著高度的相似性。嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、卷曲乳桿菌（L.crispatus）和瑞士乳桿菌（L.helveticus）的信號(hào)序列相似水平很大。DNADNA雜交試驗(yàn)證實(shí)，分類上相近的乳酸桿菌，其S-層蛋白序列也存在一定的同源性 （Boot和Pouwels，1996c）。 布 氏 乳 桿 菌 （L.buchneri）DSM 20057的染色體和短乳桿菌（L.brevis）ATCC 14869的slpA基因DNA之間具有很強(qiáng)的雜交信號(hào)，表明前者含有slpA同源序列。

3 S-層蛋白的功能

目前，大部分乳酸桿菌S-層蛋白功能并不清楚，只有部分得到證實(shí)。已有的報(bào)道表明，S-層蛋白在對(duì)宿主細(xì)胞的黏附中起作用，而其中一些蛋白質(zhì)能有效阻止致病菌對(duì)上皮細(xì)胞的黏附（Johnson-Henry 等，2007）。 L.brevis 14869 對(duì)豬的腸道上皮細(xì)胞也有很強(qiáng)的黏附力，但并未證實(shí)slpA是否參與了黏附過(guò)程。L.crispatus JCM 5810的S-層蛋白 Cbs A介導(dǎo)與腸下細(xì)胞外基質(zhì)組分膠原質(zhì)和層黏連蛋白的黏附（Antikanen等，2002）。 L.acidophilus M 92的 S-層蛋白介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)豬腸道上皮細(xì)胞的黏附（Hynonen等，2005）。

有研究者利用Western Blot方法，研究辣根過(guò)氧化物（HRP）標(biāo)記的黏蛋白受體與羅伊氏乳桿菌 JCM 1081表面蛋白的結(jié)果顯示，存在于JCM 1081菌株細(xì)胞壁表面的兩種蛋白 Mr 29000和 Mr 14000為乳桿菌 JCM1081的黏附相關(guān)蛋白。有研究表明，在陸生動(dòng)物與水產(chǎn)動(dòng)物中，乳酸菌的黏附具有菌種特異性，而無(wú)宿主特異性（Rinkinen 等，2003）。 陳營(yíng)等（2006）利用黏液模型研究了從健康牙鲆腸道中分離篩選出的乳桿菌L15與嗜酸乳桿菌ATCC 4356表面蛋白中黏附相關(guān)蛋白的種類，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，L15表面蛋白中分子質(zhì)量為61.8 kDa和54.6 kDa的蛋白質(zhì)分別參與對(duì)牙鲆和鯉魚(yú)黏液的黏附過(guò)程，ATCC 4356中分子質(zhì)量分別為43.0 kDa和63.3 kDa的兩個(gè)表面蛋白參與對(duì)牙鲆黏液的黏附，而分子質(zhì)量為43.0 kDa的蛋白參與對(duì)鯉魚(yú)黏液的黏附。同時(shí)，腸黏液中參與黏附的蛋白質(zhì)種類不隨著乳桿菌種類的改變而改變，但是相應(yīng)的細(xì)菌表面參與黏附的蛋白質(zhì)會(huì)隨著腸黏液種類的變化而有所不同。陳雪燕（2007）從豬腸道分離具有耐酸耐膽鹽和強(qiáng)黏附力的乳酸桿菌ZJ001，除去S-層蛋白后，ZJ001的自凝現(xiàn)象和對(duì)HeLa細(xì)胞的黏附力降低。同時(shí)，菌株ZJ001能競(jìng)爭(zhēng)抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌和大腸桿菌O157：H7對(duì)HeLa細(xì)胞的黏附，利用LiCl去除S-層蛋白后可降低ZJ001對(duì)病原菌黏附的拮抗作用，表明了S-層蛋白在ZJ001對(duì)病原菌黏附的拮抗中發(fā)揮了重要的作用。

4 S-層蛋白的應(yīng)用

S-層蛋白在分子工程和生物材料上具有廣闊的應(yīng)用前景，例如，S-層可以開(kāi)發(fā)成分子篩，也可作為功能分子共價(jià)吸附固定的基質(zhì)，如酶和抗體、親和膜、生物傳感器以及固相免疫分析；利用分子遺傳技術(shù)，可使外源蛋白得到表達(dá)，在細(xì)胞表面展示，從而開(kāi)發(fā)基因工程疫苗、全細(xì)胞固定化酶等（Breitwieser等，1996）?，F(xiàn)在已經(jīng)成功地表達(dá)了某些生物活性蛋白或多肽在細(xì)胞表面，如利用芽孢桿菌slp展示了果聚糖蔗糖酶、α-淀粉酶、金屬硫蛋白等（Mesnage等，1999）。

目前，關(guān)于乳酸桿菌slp基因的應(yīng)用研究是利用其啟動(dòng)子或信號(hào)序列產(chǎn)生胞內(nèi)或胞外異源蛋白。slpA基因的分泌信號(hào)已成功地應(yīng)用于許多異源蛋白的分泌和輸出（Savijoki等，1997）。研究表明，短乳桿菌（L.brevi）ATCC 8287及嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）ATCC 4356的slpA基因的啟動(dòng)子在不同的乳酸桿菌中都能獲得較高產(chǎn)量的胞內(nèi)蛋白，但啟動(dòng)子的功能與所用的宿主和報(bào)告蛋白有關(guān)。另外，利用乳酸桿菌S-層蛋白的受體結(jié)合區(qū)域異源表層表達(dá)，可使不具有黏附力的乳酸桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂叙じ搅Α⒕砬闂U菌（L.crispatus）的cbsA蛋白結(jié)合到干酪乳桿菌（L.casei）細(xì)胞壁上，使其與干酪乳桿菌蛋白酶PrtP細(xì)胞壁分類信號(hào)聯(lián)合，可使干酪乳桿菌黏附到膠原蛋白上，但其黏附力較野生型卷曲乳酸桿菌低。嗜酸乳桿菌 （L.acidophilus）ATCC 4356具有水解酶的活性，并且通過(guò)克隆使其在枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis）具有水解酶活性的C端進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果顯示，表達(dá)后的蛋白具有水解酶活性（Mariano等，2008）。

5 展望

良好的定植能力是乳酸菌發(fā)揮生理作用的基礎(chǔ)，乳酸菌表面黏附因子決定了乳酸菌能否發(fā)揮作用。通過(guò)研究S-層蛋白在乳酸菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附過(guò)程中的作用，為研究乳酸菌益生功能提供理論依據(jù)，并能為菌株的改造，提高益生菌株黏附性能提供方向。同時(shí)，由于S-層蛋白的空間結(jié)構(gòu)和基因特點(diǎn)，使其在納米生物材料、仿生學(xué)、基因工程疫苗、生物傳感器等方面均得到應(yīng)用。

[1]陳營(yíng)，王蕾，安利國(guó)，等.乳桿菌表面粘附蛋白的提取、鑒定及粘附特異性的初步研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2006，46（3）：397 ～ 400.

[2]孫明，張蕾，朱晨光，等.細(xì)菌表面S-層的結(jié)構(gòu)及其功能和應(yīng)用前景[J].微生物學(xué)報(bào)，2002，42（4）：506 ～ 509.

[3]Antikanen J，Anton L，Sillanpaa J，et al.Domains in the S-layer protein Cbs A of Lactobacillus crispatus involved in adherence to collagens，laminin and lipoteichoic acids and in self-assembly[J].Mol Microbiol，2002，46：381 ～ 394.

[4]Avall-Ja..a..skela..inen，Kyla..-Nikkia..K，Kahala M，et al.Surface display of foreign epitopes on the Lactobacillus brevis S-layer[J].Appl Environ Microbiol，2002，68：5943 ～ 5951.

[5]Boot H J，Kolen C P A M，Pouwels P H.Identification，cloning and nucleotide sequence of a silent S-layer protein gene of Lactobacillus acidophilus ATCC4356 which has extensive similarity with the S-layer Protein gene of this species[J].J Bacteriol，1995，177：7222 ～ 723.

[6]Boot H J，Kolen C.S-layer protein of Lactobacillus acidophilus ATCC 4356：purification，expression in Escherichia coli and nucleotide sequence of the corresponding gene[J].J Bacteriol，1993，175：6089 ～ 6096.

[7]Boot H J，Kolen C P A M，Pouwels P H.Interchange of the active and silent S-layer protein genes of Lactobacillus acidophilus by inversion of the chromosomal slp segment[J].Mol Microbiol，1996a，21（4）：799 ～ 809.

[8]Boot H J，Kolen C P A M，Pot B，et al.The presence of two S-layer protein encoding genes is conserved among species related to Lactobacillus acidophilus[J].Microbiology，1996b，142：2375 ～ 2384.

[9]Boot H J，Pouwels P H.Expression，secretion and antigenic variation of bacterial S-layer proteins[J].Mol Microbiol，1996c，21：1117 ～ 1123.

[10]Breitwieser A，Kupcu S，Howorka S，et al.2-D Protein crystals as an immobilization matrix for producing reaction zones in dipstick-style immunoassays[J].BioTechniques，1996，21：915 ～ 925.

[11]Brckl G，Behr M，F(xiàn)abry S，et al.Analysis and nucleotide sequence of the genes encoding the surface-layer glycoproteins of the hyperthermophilic methanogens Methanothermus fervidus and Methanothermus sociabilis[J].Eur J Biochem，1991，199：147 ～ 152.

[12]Callegari M L，Riboli B，Sanders J W，et al.The S-layer gene of Lactobacillus helveticus CNRZ892：cloning，sequence and heterologous expression[J].Microbiology，1998，144：719 ～ 726.

[13]Granato D，Perotti F，Masserey I，et al.Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii Lal to human enterocyte-like Caco-2 cells[J].Appl Environ Microbiol，1999，65（3）：1071～1077.

[14]Hagen K E，Guan L L，Tannock G W，et al.Detection，characterization，and in vivo expression of genes encoding S-proteins in Lactobacillus gallinarum strains isolated from chicken crops[J].Appl Environ Microbiol，2005，71：6633 ～ 6643.

[15]Jakava-viljanen M，Avall-Jaaskelainen S，Messner P，et al.Isolation of three new surface layer protein genes （slp）from Lactobacillus brevis ATCC 14869 and characterization of the change in their expression under aerated andAnaerobic conditions[J].J Bacteriol，2002，184：6786 ～ 6795.

[16]Johnson-Henry K C，Hagen K E，Gordonpour M，et al.Surface-layer protein extracts from Lactobacillus helveticus inhibit enterohaemorrhagic Escherichia coli O157：H7 adhesion to epithelial cells[J].Cell Microbiol，2007，9：356～367.

[17]Mariano P A，María M P，Mariana C A，et al.The S-layer of Lactobacillus acidophilus ATCC4356 shows Murein Hydrolase Activity[J].Appl Environ Microbiol，2008，171：2 ～ 8.

[18]Mesnage S，Tosi-Couture E，F(xiàn)ouet A.Production and cell surface anchoring of functional fusion proteins between the SLH motifs of the Bacillus anthracis S-layer proteins and the Bacillus subtilis levansucrase[J].Mol Microbiol，1999，31：927 ～ 936.

[19]Messner P，Allmaier G，Schaffer C，et al.Basic and application S-layer research[J].FEMS Microbiol Rev，1997，20（1 ～ 2）：25 ～ 46.

[20]Ofek I，Doyle R J.Bacterial adhesion to cells and tissues[M].New York：Chapman&Hall，1994.27 ～ 34.

[21]Rinkinen M，Westermarck E，Salminen S，et al.Absence of host specificity for in vitro adhesion of probiotic lactic acid bacteria to intestinal mucus[J].Veteri Microbiol，2003，97：55 ～ 61.

[22]Sára M，Pum D，Küpcü S，et al.Isolation of two physiologically induced variant strains of Bacillus stearothermophilus NRS 2004/3a and characterization of their S-layer lattices[J].J Bacteriol，1994，176：848 ～ 860.

[23]Sára M，Sleytr U B.S-layer Proteins[J].J Bacteriol，2000，182：859 ～ 868.

[24]Savijoki K，Kahala M，Palva A.High level heterologous protein production in Lactococcus and Lactobacillus using a new secretion system based on the Lactobacillus brevis S-layer signals[J].Gene，1997，186：255 ～ 62.

[25]Schaffer C，Graninger M，Messner P.Prokaryotic glycosylation[J].Proteomics，2001，22（4）：248 ～ 261.

[26]SillanPa..a..J，Martínez B，Antikainen J，et al.Characterization of the collagen-binding S-layer protein CbsA of Lactobaeillus crispatus[J].J Bacteriol，2000，182：6446 ～ 6450.

[27]Sleytr U B，Sára M.Bacterial and archaeal S-layer proteins：structurefunction relationships and their biotechnologicalapplications[J].Trends Biotechnol，1997，15：20 ～ 26.

[28]Vidgren G，Palva l，Pakkanen R，et al.S-layer protein gene of Lactobacillus brevis：cloning by Polymerase chain reaction and determination of the nucleotide and sequence[J].J Bacteriol，1992，174：7419 ～ 7427.