HIF-1α與SDF-1α/CXCR4在星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧應(yīng)激過程中的調(diào)控機制與作用

黃生炫， 安 宇， 李 靜， 熊云彪， 許長平， 楊 恒， 楊承勇， 譚新杰， 劉窗溪

腦梗死為一臨床常見的疾病類型，目前治療方法主要有溶栓、神經(jīng)保護(hù)、康復(fù)等，但均未能從根本上解決因梗死后導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡。為此，國內(nèi)外大量的學(xué)者對腦梗死后以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞修復(fù)治療展開了系列研究，譚新杰等人［1］在研究成年大鼠大腦中動脈栓塞缺血再灌注時發(fā)現(xiàn)缺氧應(yīng)激可激活神經(jīng)元前體細(xì)胞的發(fā)生，并誘導(dǎo)神經(jīng)元前體細(xì)胞朝著梗死區(qū)域遷移，但細(xì)胞在缺血灶中的遷移機制尚未明確。

了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞在缺氧應(yīng)激過程中的遷移機制有利控制其中的調(diào)控環(huán)節(jié)，增加其遷移效率，進(jìn)而促進(jìn)梗死區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)。本文以中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的星形膠質(zhì)細(xì)胞為研究對象，模擬腦梗死時的缺氧環(huán)境，探討在缺氧應(yīng)激過程中HIF-1α與SDF-1α/CXCR4的調(diào)控關(guān)系，以期為腦梗死的干細(xì)胞治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗材料與試劑 出生24h內(nèi)的SD乳鼠由貴陽醫(yī)學(xué)院動物中心提供，DMEM/F12購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季清公司，CoCl2購自Sigma公司，GFAP抗體購自北京博奧森公司，倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品，siRNA由本研究組和大連寶生物公司共同設(shè)計合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，ELISA試劑盒購自美國USCN公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 使用酶消化及機械吹打法培養(yǎng)SD乳鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞。免疫組織化學(xué)方法對星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1．3 HIF-1α沉默表達(dá)載體構(gòu)建 由本研究組和大連寶生物公司根據(jù)NCBI大鼠HIF-1α基因序列設(shè)計合成siRNA片段及其陰性對照片段。大鼠HIF-1α基因的siRNA序列為CCAGTTACGATTGTGAAGT。其陰性對照序列為GCCTTATACGCGATTAAGA。

1．4 實驗分組

1．4．1 未沉默缺氧組 培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞至80% ～90%融合，以終濃度分別為 0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L 的 CoCl2處理細(xì)胞，分別在0h、4h、16h、24h、36h 提取總RNA，留存培養(yǎng)基上清于－20℃冰箱備用。

1．4．2 沉默陽性缺氧組 培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞至80% ～90%融合，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染siHIF-1α質(zhì)粒48h后，以終濃度為 50μmol/L CoCl2處理細(xì)胞，分別在0h、4h、16h、24h、36h 提取總RNA，留存培養(yǎng)基上清于－20℃冰箱備用。

1．4．3 沉默陰性缺氧組 培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞至80%～90%融合，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染陰性空質(zhì)粒48h后，以終濃度為50μmol/L CoCl2處理細(xì)胞，分別在0h、4h、16h、24h、36h 提取總 RNA，留存培養(yǎng)基上清于－20℃冰箱備用。以上實驗均獨立重復(fù)3次。

1．5 RT-PCR 檢測 HIF-1α、SDF-1αmRNA 表達(dá)根據(jù)SD大鼠GeneBank，各目的基因PCR引物序列由上海生工合成。HIF-1α引物序列:上游引物:5’-TGCTCATCAGTTGCCACTTC-3’;下游引物:5’-CATGGTCACATGGATGGGTA-3’，擴 增 長 度 為310bp。SDF-1α引物序列:上游引物:5’-CAGCCGTGCAACAATCTGAAG-3’;下游引物:5’-CTGCATCAGTGACGGTAAACC-3’，擴增長度為124bp。β-actin引物序列:上游引物:5’-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3’;下游引物:5’-ACCCAGGAAGGAAGGCT-3’，擴增長度:194bp。提取總RNA并檢測其純度濃度及完整性。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、半定量分析上述基因mRNA表達(dá)。各取10μl產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，運用Alpha Imager型圖像分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，分別測出HIF-1α、SDF-1α擴增帶的光密度值(OD值)，并以β-actin擴增帶的光密度值作為參照，得出HIF-1α、SDF-1α與β-actin光密度值的相對比值。

1．6 ELISA檢測 各實驗組星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清SDF-1α含量，按試劑盒說明書操作。

1．7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18．0統(tǒng)計軟件數(shù)據(jù)統(tǒng)計多組間均數(shù)比較采用方差分析、兩組間比較采用t檢驗，P＜0．05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2．1 星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定 原代細(xì)胞成分復(fù)雜，隨著傳代次數(shù)增加，異種細(xì)胞逐漸被淘汰，于第3代可獲得形態(tài)均一的純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞呈長梭形，漩渦狀排列(見圖1);GFAP免疫熒光及DAB染色符合星形膠質(zhì)細(xì)胞特征(見圖2、3)。

2．2 星形膠質(zhì)細(xì)胞未沉默缺氧組 HIF-1α、SDF-1α mRNA表達(dá)水平及SDF-1α蛋白分泌水平經(jīng)預(yù)實驗后發(fā)現(xiàn)，不同濃度CoCl2、不同處理時間刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞，其HIF-1α和SDF-1α mRNA表達(dá)上調(diào)，且與CoCl2濃度及處理時間密切相關(guān)(其中50μmol/L的CoCl2處理其變化趨勢明顯，以下結(jié)果用該組數(shù)據(jù)說明)。以終濃度50μmol/LCoCl2處理0h、4h、16h、24h、36h 后檢測 HIF-1α 和 SDF-1α mRNA表達(dá)。CoCl2處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后 HIF-1α和SDF-1α mRNA 表達(dá)上調(diào)(P＜0．05)(見圖4、5)。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中的SDF-1α蛋白表達(dá)量上調(diào)(P＜0．05)(見圖6)。

2．3 建立沉默HIF-1α基因表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞模型 用脂質(zhì)體2000將siHIF-1α陽性沉默質(zhì)粒及陰性對照空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞48h后檢測HIF-1α mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示陽性沉默組HIF-1α mRNA較陰性沉默組表達(dá)明顯降低(P＜0．05)(見圖7、8)，說明星形膠質(zhì)細(xì)胞HIF-1α陽性沉默模型中HIF-1α基因表達(dá)受到沉默抑制。

2．4 星形膠質(zhì)細(xì)胞沉默陽性缺氧組中 HIF-1α、SDF-1α mRNA表達(dá)水平及SDF-1α蛋白分泌水平 用脂質(zhì)體2000將siHIF-1α陽性沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞48h后，以終濃度50μmol/LCoCl2處理0h、4h、16h、24h、36h 后檢測 HIF-1α、SDF-1α mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示HIF-1α、SDF-1α mRNA變化不明顯(P＞0．05)(見圖9、10)。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)基上清中 SDF-1α蛋白表達(dá)量無明顯變化(P＞0．05)(見圖11)。

2．5 星形膠質(zhì)細(xì)胞沉默陰性缺氧組中HIF-1α、SDF-1α mRNA表達(dá)水平及SDF-1α蛋白分泌水平采用脂質(zhì)體2000將陰性對照空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞48h 后，以終濃度50μmol/L CoCl2處理0h、4h、16h、24h、36h后檢測 HIF-1α、SDF-1α mRNA 表達(dá)。結(jié)果顯示 HIF-1α、SDF-1α mRNA 表達(dá)上調(diào)(P＜0．05)(見圖12、13)。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)基上清中的SDF-1α蛋白表達(dá)量上調(diào)(P＜0．05)(見圖14)。

3 討論

缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是體內(nèi)維持氧穩(wěn)態(tài)的重要轉(zhuǎn)錄因子，它通過結(jié)合低氧反應(yīng)基因的低氧反應(yīng)元件(hypoxia response element，HRE)，參與調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的一系列基因的表達(dá)，使機體更好地適應(yīng)低氧環(huán)境［2，3］。與HIF-1不一樣，SDF-1是趨化因子CXC亞家族的一個成員。它廣泛地表達(dá)于多種細(xì)胞和組織中，并大量及選擇性地在發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。能與其唯一受體CXCR4相互特異性結(jié)合構(gòu)成一個與細(xì)胞間信息傳遞、細(xì)胞遷移密切相關(guān)的偶聯(lián)分子對［4］。在關(guān)于 HIF-1與 SDF-1、CXCR4關(guān)系的研究中，Schioppa T等［5］發(fā)現(xiàn)缺氧能通過HIF-1α的激活而上調(diào)人類單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞上CXCR4的表達(dá)，并提出缺氧-HIF-1α-CXCR4通路可能是調(diào)控缺氧條件下不同類細(xì)胞遷移的機制。Ceradini DJ等［6］在研究低氧環(huán)境中的局部損傷組織時發(fā)現(xiàn)，低氧可激活對缺氧敏感的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1，調(diào)控SDF-1表達(dá)使其增多，并形成適合干細(xì)胞存在及生長的微環(huán)境，通過SDF-1促進(jìn)CXCR4陽性的干細(xì)胞黏附、遷移和歸巢到缺氧部位，參與血管形成，這說明SDF-1基因啟動子區(qū)內(nèi)含有低氧反應(yīng)元件，HIF-1與HRE結(jié)合而激活SDF-1的表達(dá)。李梅等［7］在研究低氧對大鼠肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α及SDF-1表達(dá)影響時，證實HIF-1與SDF-1存在信號調(diào)節(jié)關(guān)系，在介導(dǎo)祖細(xì)胞遷移和黏附至肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的過程中起重要作用。在中樞神經(jīng)組織中是否也存在缺氧-HIF-1-SDF-1/CXCR4通路，本文就此展開初步研究。

我們利用CoCl2中Co2+可以取代氧感受器血紅蛋白卟啉環(huán)中的Fe2+，Co2+對氧的親和力較低，使血紅蛋白不能與氧結(jié)合，從而誘導(dǎo)促紅細(xì)胞生成素及其他對低氧敏感基因表達(dá)增加，這樣就模擬了細(xì)胞的缺氧狀態(tài)［8］。本研究采用 50μmol/L CoCl2刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞模擬缺氧，在處理4h后，細(xì)胞中HIF-1α及SDF-1α mRNA表達(dá)開始上升并達(dá)到峰值，隨著時間推移，HIF-1α及SDF-1αmRNA表達(dá)下降呈下降趨勢。該結(jié)果從轉(zhuǎn)錄水平說明星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧應(yīng)激過程中HIF-1α mRNA表達(dá)增加，可以推測此時HIF-1α與HRE結(jié)合而激活SDF-1α的表達(dá)。SDF-1基因啟動子區(qū)內(nèi)含有低氧反應(yīng)元件［7］。在檢測相應(yīng)標(biāo)本缺氧后不同時間點培養(yǎng)基上清中的SDF-1α蛋白時，我們發(fā)現(xiàn)缺氧16h后SDF-1α蛋白表達(dá)達(dá)一峰值，而后下降，至缺氧24h后SDF-1α蛋白表達(dá)又呈上升趨勢，并超過前一峰值。說明在SDF-1 mRNA表達(dá)上調(diào)后，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也上調(diào)。但在缺氧24h后SDF-1α蛋白表達(dá)又呈上升趨勢，可能與CoCl2再次刺激HIF-1基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。為進(jìn)一步說明SDF-1基因啟動子區(qū)內(nèi)含有低氧反應(yīng)元件，我們根據(jù)HIF-1基因序列設(shè)計相應(yīng)的小干擾RNA(siHIF-1α)，誘導(dǎo) HIF-1基因沉默，在轉(zhuǎn)染48h后用50μmol/L CoCl2處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，分別在不同時間點檢測 HIF-1α、SDF-1α mRNA，結(jié)果顯示HIF-1α、SDF-1α mRNA變化不明顯，檢測培養(yǎng)基上清中SDF-1α中的含量，發(fā)現(xiàn)SDF-1α含量維持在較低水平，缺氧的刺激未能引起SDF-1含量的變化。這說明脂質(zhì)體2000將siHIF-1α陽性沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒啟動子轉(zhuǎn)錄出的siRNA降解了HIF-1α mRNA，引起HIF-1基因表達(dá)沉默，此時無HIF-1與HRE結(jié)合而充分激活SDF-1 mRNA的表達(dá)，其對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也相應(yīng)下調(diào)，以至培養(yǎng)液中的SDF-1α含量無明顯改變。也說明該脂質(zhì)體載體能夠有效地將HIF-1α特異性 siRNA導(dǎo)入星形膠質(zhì)細(xì)胞，實現(xiàn)HIF-1α的沉默。而在轉(zhuǎn)染48h用CoCl2處理24h后培養(yǎng)液中的SDF-1含量稍有升高，可能與HIF-1α的mRNA未完全沉默、再次受到缺氧刺激有關(guān)。用脂質(zhì)體2000將陰性對照空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞后，因空載體未插入特異性沉默HIF-1α的目的片斷，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒啟動子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不能降解HIF-1α mRNA，HIF-1α mRNA表達(dá)不受影響。以上實驗可以明確SDF-1基因啟動子區(qū)內(nèi)含有HRE。缺氧刺激時，細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)上調(diào)，HIF-1與HRE結(jié)合而激活SDF-1α mRNA表達(dá)上調(diào)，其蛋白表達(dá)產(chǎn)物SDF-1α表達(dá)增加。說明缺氧-HIF-1-SDF-1/CXCR4通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中確實存在。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中明確該通路，有利于進(jìn)一步使用神經(jīng)干細(xì)胞治療腦梗死，如將CXCR4基因轉(zhuǎn)染到神經(jīng)干細(xì)胞中，可能使后者對梗死部位分泌的SDF-1α的趨化能力明顯增強，達(dá)到修復(fù)梗死區(qū)域的目的。再比如將HIF-1注射到梗死部位，有利于神經(jīng)干細(xì)胞遷移到修復(fù)梗死區(qū)域。盡管缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α與SDF-1α/CXCR4通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺氧中存在調(diào)控關(guān)系。但是還有很多問題不明確，例如SDF-1α/CXCR4通路是否能直接介導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移;HIF-1α是否通過SDF-1α/CXCR4通路調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的遷移;若是SDF-1α/CXCR4通路能直接介導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移，其具體機制尚需進(jìn)一步研究。總之，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞遷移機制的進(jìn)一步研究，將有利于對腦梗死后以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞修復(fù)治療。

圖1～3 星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

圖4～6 星形膠質(zhì)細(xì)胞未沉默缺氧組HIF-1α、SDF-α mRNA表達(dá)水平及SDF-α蛋白分泌水平

圖7～8 HIF-1α陽性沉默質(zhì)粒及陰性對照組空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞48h后情況

圖9～11 星形膠質(zhì)細(xì)胞沉默陽性缺氧組中HIF-1α陽性沉默質(zhì)粒及陰性對照組空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞48h后情況圖12～14 星形膠質(zhì)細(xì)胞沉默陰性缺氧組中HIF-1α陽性沉默質(zhì)粒及陰性對照組空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞48h后情況

［1］譚新杰，胡長林，蔡文琴，等．成年大鼠局灶性腦梗死后神經(jīng)元前體細(xì)胞的遷移研究［J］．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，27(22):2242－2244．

［2］喬泰東，劉長江，時永全，等．絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1對缺氧誘導(dǎo)因子-1轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)機制的研究［J］．中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85:555 －559．

［3］吳 強，楊述華，葉樹楠，等．RNA干擾沉默缺氧誘導(dǎo)因子-1治療骨肉瘤的實驗研究［J］．中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85:409 －413．

［4］Luo YG，Cai JL，Xue liP，et al．Functional SDF-1a/CXCR4 sigrIaliIlg inthe developing spinal cord［J］．J Neurochem，2005，93(2):452 －462．

［5］Schioppa T，Uranchimeg B，Saccani A，et al．Regulation of the chemokine receptor CXCR4 by hypoxia［J］．J Exp Med，2003，198:1391 －1402．

［6］Ceradini DJ，Kulkami AR，Callaghan MJ，et al．Progenitor celltraf ticking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1［J］．Nat Med，2004，10:858 －864．

［7］李 梅，揭 偉，吳秋良，等．HIF-1α/SDF-1信號軸在低氧誘導(dǎo)祖細(xì)胞遷移和黏附中的作用［J］．中國病理生理雜志，2010，26(11):2165－2170．

［8］Fukuda R，Hirota K，F(xiàn)an F，et al．Insulin-like growth factor 1 induces hypoxia-inducible factor 1-mediated vascularendothelial growth factor exp ression，which is dependent on MAP kinase and phos phatidylinosit ol 3-kinase signaling in col on cancer cells［J］．J Biol Chem，2002，277(41):38205 －38211．