延髓缺血對(duì)其微血管密度、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響

朱 江， 郭 森， 孫艷軍， 馮亞茹， 來(lái) 錦

隨著全球人口老齡化的到來(lái)，腦血管病特別是缺血性腦卒中發(fā)病率日益增高。臨床常見(jiàn)的缺血性腦血管?。?，2］，都是由頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)或椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)的某一分支病變引起的。其中，椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)缺血性疾病占缺血性腦卒中的 20%［3，4］。延髓(medulla oblongata)是人類的生命中樞，含有大量神經(jīng)元，神經(jīng)元周圍有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞填充。正常生理情況下，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管緊密結(jié)合在一起，星形膠質(zhì)細(xì)胞突起伸展填充在神經(jīng)元胞體及其突觸之間［5］。在后循環(huán)缺血過(guò)程中延髓內(nèi)微血管及神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的病理改變尤其值得關(guān)注。本研究通過(guò)阻斷大鼠相應(yīng)血管模擬后循環(huán)缺血后的病理過(guò)程，建立延髓缺血模型，應(yīng)用單寧酸-氯化鐵媒染法［6～8］、HE染色等方法觀察缺血后不同時(shí)段延髓內(nèi)微血管、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的改變，為后循環(huán)缺血［9］的診斷治療提供形態(tài)學(xué)資料。

1 材料和方法

1．1 材料 SPF級(jí)Wistar成年健康雄性大鼠，200～220g(由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。10%多聚甲醛固定液、0．1mol PB溶液、單寧酸(tannic acid)、氯化鐵(FeCl3)、蘇木精、伊紅、10% 水合氯醛、青霉素、高頻電刀、顯微手術(shù)器械、分析天平、冰凍切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡、顯微鏡及攝像裝置。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 48只大鼠隨機(jī)分為4組:即實(shí)驗(yàn)組(1w組、2w組、3w組)和對(duì)照組，每組12只。其中實(shí)驗(yàn)組大鼠阻斷雙側(cè)椎動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈。存活時(shí)間分別是1w、2w、3w。對(duì)照組只暴露雙側(cè)椎動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈，不做血管阻斷處理。

1．2．2 延髓缺血模型制備 結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈:10%水合氯醛腹腔注射麻醉(350mg/kg)，仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎切斷，檢查無(wú)活動(dòng)性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。電凝椎動(dòng)脈:大鼠俯臥固定，于后正中線第一頸椎水平處作縱形切口，沿中線分開(kāi)肌層，暴露第一頸椎橫突孔，將高頻電刀的電凝刀頭插入橫突孔內(nèi)凝閉椎動(dòng)脈3～4s，檢查無(wú)活動(dòng)性出血后，用生理鹽水和青霉素(1×105U/L)沖洗后縫合傷口。待清醒后，單籠保溫喂養(yǎng)。

1．2．3 HE染色標(biāo)本制作、單寧酸-氯化鐵染色標(biāo)本制作 按文獻(xiàn)［10］方法取出延髓標(biāo)本，進(jìn)行HE染色標(biāo)本制作。按文獻(xiàn)方法［6］制作單寧酸-氯化鐵染色標(biāo)本。

1．2．4 神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)及微血管密度定量分析方法 每只大鼠取4張切片，每張切片在200倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，輸入醫(yī)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)(MiVnt)進(jìn)行圖像處理，計(jì)數(shù)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，取其平均值為這只大鼠的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)。每只大鼠取3張切片，采用Mivnt圖像分析系統(tǒng)定量分析延髓微血管密度(microvessel density，MVD)和微血管面積比(microvessel aera density，MVA)。每張切片在100倍光鏡下選5個(gè)視野，分別計(jì)算MVD值和MVA值，取平均值作為該只大鼠延髓微血管的MVD值和MVA值。

1．2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用 S PSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 延髓缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷慕?電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，建立了延髓缺血模型。

2．2 延髓缺血模型腦組織大體標(biāo)本觀察 雄性Wistar大鼠共48只，其中觀察實(shí)驗(yàn)組36只，對(duì)照組12只動(dòng)物。在大體標(biāo)本上可見(jiàn)，第一周大腦橫裂較對(duì)照組略顯增寬，雙側(cè)大腦半球基本對(duì)稱。第2周大腦橫裂較第1周的略有增寬，右側(cè)大腦半球較左側(cè)略萎縮，小腦可見(jiàn)萎縮。第3周大腦橫裂顯著增寬，小腦萎縮明顯，雙側(cè)大腦半球不對(duì)稱，右側(cè)萎縮明顯。取材時(shí)可見(jiàn)，腦組織與顱骨之間空隙增寬，第四腦室略有擴(kuò)大。本次試驗(yàn)采取阻斷雙側(cè)椎動(dòng)脈并結(jié)扎右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈法進(jìn)行相應(yīng)的比較，大體標(biāo)本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物延髓處可見(jiàn)明顯缺血表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)各組的缺血部位較對(duì)照組明顯萎縮(見(jiàn)圖1、2、3、4)。

2．3 延髓缺血模型微血管密度(MVD)、微血管面積比(MVA)變化 通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)各組1w、2w、3w的觀察，延髓微血管密度(MVD)增加(47．28 ±8．67，61．92 ±11．37，78．33 ±14．62)，與對(duì)照組(104．16 ±15．63)相比較P＜0．05，P＜0．01;微血管面積比(MVA)增大(0．0246 ±0．0048，0．0366 ±0．0098，0．0399 ±0．0131)，與對(duì)照組(0．0614±0．0018)比較P＜0．05或P＜0．01，二者均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表1、2)。

2．4 延髓缺血對(duì)神經(jīng)元的影響 實(shí)驗(yàn)組中，通過(guò)對(duì)1w、2w、3w后試驗(yàn)動(dòng)物的觀察，神經(jīng)元數(shù)量減少(4．35 ±2．61，4．32 ±1．83，3．91 ±0．78)，與對(duì)照組(8．60 ±2．82)相比較(P＜0．05)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(見(jiàn)表3)。

2．5 延髓缺血對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響 實(shí)驗(yàn)各組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加(21．25 ±4．56，29．56 ±3．65，48．36 ±5．32)，與對(duì)照組(15．34 ±2．56)相比較P＜0．05或P＜0．01，有非常顯著的差異(見(jiàn)表4)。

2．6 組織學(xué)觀察

2．6．1 對(duì)照組:微血管、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)基本正常，細(xì)胞膜完整，核膜、核仁清晰，尼氏體豐富。

表1 各組MVD值變化情況(±s)

表1 各組MVD值變化情況(±s)

與對(duì)照組組內(nèi)比較*P ＜0．05，＊＊P ＜0．0

組別 數(shù)量 MVD(100倍視野)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)1w組實(shí)驗(yàn)2w組實(shí)驗(yàn)3w組12 12 12 12 104．16 ±15．63 47．28 ±8．67＊＊61．92 ±11．37＊＊78．33 ±14．62*

表2 各組MVA值變化情況(±s)

表2 各組MVA值變化情況(±s)

與對(duì)照組組內(nèi)比較*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

組別 數(shù)量 MVA(100倍視野)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)1w組實(shí)驗(yàn)2w組實(shí)驗(yàn)3w組12 12 12 12 0．0614 ±0．0018 0．0246 ±0．0048＊＊0．0366 ±0．0098＊＊0．0399 ±0．0131*

2．6．2 實(shí)驗(yàn)組:(1)1w組微血管閉塞，數(shù)量減少，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，膜結(jié)構(gòu)不清，甚至斷裂。神經(jīng)元數(shù)量減少，核固縮、碎裂、溶解，細(xì)胞器溶解消失。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核較大，有明顯核仁。(2)2w組神經(jīng)元較1w組數(shù)量略減少，神經(jīng)元溶解消失。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增加明顯，壞死區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)大量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞填充，細(xì)胞較大，核較小，顏色較淺。(3)3w組微血管量增加，內(nèi)皮細(xì)胞正常，神經(jīng)元數(shù)量減少，壞死性病灶內(nèi)神經(jīng)元破碎，甚至完全消失。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，仍處于增殖狀態(tài)，在一些受損的神經(jīng)元周圍出現(xiàn)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞核深染，排列較雜亂((見(jiàn)圖5～圖12)。

表3 神經(jīng)元數(shù)量(±s)

表3 神經(jīng)元數(shù)量(±s)

與對(duì)照組組內(nèi)比較*P＜0．05

組別 數(shù)量 神經(jīng)元數(shù)量(200倍視野)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)1w組實(shí)驗(yàn)2w組實(shí)驗(yàn)3w組12 12 12 12 8．60 ±2．82 4．35 ±2．61*4．32 ±1．83*3．91 ±0．78*

表4 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(±s)

表4 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(±s)

與對(duì)照組組內(nèi)比較*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

組別 數(shù)量 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(200倍視野)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)1w組實(shí)驗(yàn)2w組實(shí)驗(yàn)3w組12 12 12 12 15．34 ±2．56 21．25 ±4．56*29．56 ±3．65＊＊48．36 ±5．32＊＊

3 討論

腦干的血液供應(yīng)復(fù)雜，大部分的血供來(lái)源于椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)。以往的研究，應(yīng)用阻斷基底動(dòng)脈的方法建立腦干缺血的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。Miura等［11，12］應(yīng)用雙點(diǎn)電凝基底動(dòng)脈建立腦干缺血模型。上述實(shí)驗(yàn)，術(shù)中需開(kāi)顱，術(shù)式復(fù)雜。同時(shí)考慮直接阻斷基底動(dòng)脈，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)瞬間出現(xiàn)意識(shí)障礙、抽搐、呼吸淺快等表現(xiàn)，存活率較低。本實(shí)驗(yàn)考慮，大鼠雙側(cè)椎動(dòng)脈延伸匯成基底動(dòng)脈，試用電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈的方法建立延髓缺血模型。但通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，延髓缺血病灶不固定?？紤]這與大鼠腦動(dòng)脈環(huán)完整、相應(yīng)的血流代償機(jī)制完善有關(guān)。

參考以上實(shí)驗(yàn)方法，本研究嘗試多點(diǎn)阻斷腦動(dòng)脈法即同時(shí)阻斷雙側(cè)椎動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈，建立延髓缺血模型。上述方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的條件要求單一，術(shù)式易操作。電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈，不需開(kāi)顱，操作簡(jiǎn)單安全，能較確切的對(duì)血管進(jìn)行阻斷。直接結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，不應(yīng)用線栓法，可避免血管穿通出現(xiàn)的繼發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血等副損傷。實(shí)驗(yàn)證明，在大體標(biāo)本上不經(jīng)任何染色就可清晰直觀的看出腦組織的萎縮。微血管構(gòu)筑、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變。因此，該模型具有缺血部位固定、重復(fù)性較好、成活率較高的優(yōu)點(diǎn)。

腦梗死后新生微血管增生的機(jī)制還不十分明確。利用微血管特定的標(biāo)記物質(zhì)，如CD31等標(biāo)記新生微血管觀察發(fā)現(xiàn)［13，14］，在腦梗死后1w可見(jiàn)相關(guān)陽(yáng)性標(biāo)記物出現(xiàn)，在隨后的2w、3w內(nèi)新生微血管的密度不斷增加。特別是在腦梗死后的第2周，新生微血管標(biāo)記物陽(yáng)性率最高。在形態(tài)學(xué)方面，不論是通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡、還是應(yīng)用激光共聚焦三維重建等技術(shù)，都可以發(fā)現(xiàn)在腦梗死1w時(shí)，會(huì)出現(xiàn)部分微血管閉塞，甚至可以看見(jiàn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的斷裂等現(xiàn)象，但在隨后的2w、3w微血管形態(tài)學(xué)較對(duì)照組未見(jiàn)明顯變化［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之有相似之處，通過(guò)微血管密度、微血管面積比可證實(shí)，缺血2～3w血管明顯增多，增多的血管可能是新生的血管，今后的實(shí)驗(yàn)可通過(guò)相應(yīng)的標(biāo)記加以證實(shí)。筆者認(rèn)為，在了解新生微血管隨腦梗死的時(shí)間變化規(guī)律基礎(chǔ)上，對(duì)微血管總體密度的統(tǒng)計(jì)，更加直觀的反映出腦梗死對(duì)微血管的影響。經(jīng)試驗(yàn)研究顯示，延髓缺血后1w，微血管密度減低;2w時(shí)微血管的密度明顯升高，較對(duì)照組少;3w時(shí)微血管密度進(jìn)一步升高，仍少于對(duì)照組。

作為腦組織細(xì)胞中重要組成部分，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用，如清除自由基、為突觸再生提供穩(wěn)定的離子狀態(tài)、提供生長(zhǎng)因子等。本研究提示，延髓缺血后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞總體處于增殖狀態(tài)。1w時(shí)神經(jīng)膠質(zhì)增殖，數(shù)量較對(duì)照組增加，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間排列緊密，細(xì)胞核較大而致密，有的病灶中心可見(jiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞充斥。2w時(shí)表現(xiàn)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在數(shù)量上仍保持增加的趨勢(shì)，可見(jiàn)在神經(jīng)元周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，排列較整齊，膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核深染，細(xì)胞核較小，顏色致密。3w時(shí)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步增殖，數(shù)量顯著高于對(duì)照組。在一些皺縮的神經(jīng)元周圍出現(xiàn)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞核深染，排列較雜亂。膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量在延髓缺血發(fā)生后3w內(nèi)總的變化趨勢(shì)是始終處于增殖狀態(tài)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與微血管密度的變化方面有一部分時(shí)段變化方向相同，即在腦缺血發(fā)生后的第2、3周，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與微血管密度在數(shù)量上統(tǒng)計(jì)均處于持續(xù)增長(zhǎng)的狀態(tài)。腦缺血性疾病后微血管的擴(kuò)張、增生相關(guān)機(jī)制目前還處于研究階段。缺血時(shí)在大鼠腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放諸多如PGI2等［16］神經(jīng)介質(zhì)，這些神經(jīng)介質(zhì)可能會(huì)為腦組織中新生微血管增生提供條件，成為對(duì)缺血條件下腦組織的相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制。但兩者之間是否存在相關(guān)性及更深一步增殖機(jī)制有待研究。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持腦細(xì)胞內(nèi)環(huán)境方面有重要功能，同時(shí)還擔(dān)負(fù)著為神經(jīng)元供能、提供營(yíng)養(yǎng)因子的職責(zé)。缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生在實(shí)驗(yàn)后第一周可見(jiàn)。在2w、3w的研究觀察中，神經(jīng)元出現(xiàn)崩解現(xiàn)象。在缺血條件下，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量增生會(huì)影響到微循環(huán)，引起局部微循環(huán)障礙。從而進(jìn)一步加重神經(jīng)元的缺血缺氧表現(xiàn)，在持續(xù)低灌注狀態(tài)下會(huì)出現(xiàn)大量神經(jīng)元胞體破碎、凋亡。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在腦缺血條件誘導(dǎo)下，延髓內(nèi)部微血管、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之間存在相互影響。隨著延髓缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生為微血管的新生提供了必要的基礎(chǔ)。同時(shí)微血管的增生本身也為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖提供能量的貯備。實(shí)驗(yàn)時(shí)間進(jìn)一步推移，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量增生后，出現(xiàn)了病灶局部的微循環(huán)改變，出現(xiàn)局部微循環(huán)障礙，導(dǎo)致神經(jīng)元的減少，考慮出現(xiàn)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。

圖1 對(duì)照組

圖2 實(shí)驗(yàn)1w組

圖3 實(shí)驗(yàn)2w組

圖4 實(shí)驗(yàn)3w組

圖5 對(duì)照組HE×200

圖6 實(shí)驗(yàn)1w組HE×200

圖7 實(shí)驗(yàn)2w組HE×200

圖8 實(shí)驗(yàn)3w組HE×200

圖9 對(duì)照組TA-FE×100

圖10 實(shí)驗(yàn)1w組TA-FE×100

圖11 實(shí)驗(yàn)2w組TA-FE×100

圖12 實(shí)驗(yàn)3w組TA-FE×100

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