腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子修飾的神經(jīng)干細(xì)胞移植對阿爾茨海默病大鼠的學(xué)習(xí)及p75表達(dá)的影響

楊華山 ， 王金國

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又稱為老年性癡呆，是一種與年齡相關(guān)的進(jìn)行性記憶喪失和高級認(rèn)知功能減退的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進(jìn)行性減退，并伴有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙，給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)［1］。因此，人們進(jìn)行了大量的研究去探索該病的發(fā)病機(jī)制及治療該病的新的有效的方法。一些學(xué)者在研究該病的發(fā)病機(jī)制及病理改變中發(fā)現(xiàn)p75蛋白與AD病理過程密切相關(guān)，海馬CA1區(qū)的p75大量表達(dá)往往伴隨著大量神經(jīng)細(xì)胞的在量丟失［2］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的p75引起了學(xué)習(xí)記憶的障礙［3］，這些結(jié)果提示p75促進(jìn)了AD的發(fā)展，有效地抑止p75的表達(dá)，可以起到治療的作用。

目前，神經(jīng)干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用日益受到研究人員的重視，國內(nèi)外的大量文獻(xiàn)報道神經(jīng)干細(xì)胞移植可以有效地延緩AD病的發(fā)展或者減輕AD病的癥狀［4］。而經(jīng)BDNF修飾后的神經(jīng)干細(xì)胞是否具有更好的治療作用目前還沒有相關(guān)的報道。在本實驗中，我們擬通過移植經(jīng)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)修飾過的神經(jīng)干細(xì)胞來觀察其對AD大鼠的學(xué)習(xí)及海馬區(qū)p75的表達(dá)影響，從而為AD的治療尋找新的治療方法與途徑。

1 材料與方法

1．1 實驗動物與主要試劑及材料 36只健康雄性SD大鼠(3～4月齡，體重260～320g)，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供。通過Y型水迷宮和跳水試驗，從中篩選出24只反應(yīng)迅速、動作靈敏的大鼠作為試驗對象。淀粉樣β蛋白1-40(Aβ1-40購自Sigma公司)，BDNF及p75抗體均購自武漢博士德公司。內(nèi)參GAPDH購自杭州賢至生物有限公司。Y型電迷宮(張家港生物醫(yī)學(xué)儀器廠)、熒光顯微鏡(日本尼康E600)、大鼠立體定向儀SN-2型(日本東京成茂科學(xué)器械研究所)。

1．2 實驗方法

1．2．1 AD 模型的制作與分組 Aβ1-40溶于無菌生理鹽水(2μg/μl)，用前37℃孵育1w以上，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)。按35mg/kg的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉SD大鼠，參照包新民等編著大鼠腦立體定位圖譜，使用立體定向器定位大鼠的海馬注射點(diǎn)，每側(cè)海馬注射5μl淀粉樣β蛋白，10min內(nèi)注完，并留針10min［5］。造模成功后隨機(jī)將AD大鼠分為3組:溶劑對照組(vehicle)、神經(jīng)干細(xì)胞移植組(NSC)和經(jīng)BDNF修飾的神經(jīng)干細(xì)胞(BDNF-NSC)移植組。

1．2．2 帶有BDNF基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 BDNFNSC組移植前1d，將帶有BDNF基因片段的質(zhì)粒12μg加入500μl不含血清的DMEM培養(yǎng)基中，同時再配制含12μl脂質(zhì)體和500μl DMED培養(yǎng)基的混合液體，然后將兩液體混合到一起，同時用吹管吹打均勻，45min后加入2ml含2×105個神經(jīng)干細(xì)胞的懸液中［6］。孵育24h后采用RT-PCR技術(shù)檢測BDNF基因在NSC中的表達(dá)，效果滿意后進(jìn)行下一步實驗。

1．2．3 BDNF修飾的神經(jīng)干細(xì)胞移植 在3個實驗組中，BDNF-NSC組和NSC組分別經(jīng)立體定位器向側(cè)腦室注入5μl(約3×105)的 BDNF-NSC和NSC細(xì)胞懸液，溶劑對照組只給予相同劑量的細(xì)胞培養(yǎng)液。注射選定的側(cè)腦室坐標(biāo)為:前鹵后0．6mm、中線左 1．5mm、硬膜下 4mm，注射速度為 0．5μl/mm，留針10min。

1．2．4 AD大鼠行為學(xué)檢測 于腦內(nèi)移植細(xì)胞或培養(yǎng)基后4w進(jìn)行Y型電迷宮試驗，用于檢測各組AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。(1)學(xué)習(xí)能力測試:將大鼠受電擊后從起步區(qū)直接逃至安全區(qū)作為正確反應(yīng)，而以連續(xù)10次試驗中大鼠做出9次(9/10)正確反應(yīng)所需總的電擊次數(shù)(即嘗試次數(shù))表示其學(xué)習(xí)獲得能力;(2)記憶再現(xiàn)測試:上述達(dá)標(biāo)大鼠休息24h后，同法檢測其記憶力。以達(dá)到9/10標(biāo)準(zhǔn)前的嘗試次數(shù)表示記憶再現(xiàn)能力［7］。

1．2．5 免疫組織化學(xué)法檢測BDNF-NCS在各組中的表達(dá) 迷宮試驗結(jié)束后各組大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉(3ml/kg)后，經(jīng)主動脈相繼灌注生理鹽水100ml、40g/L多聚甲醛(4℃)350ml。快速取腦，固定后于移植點(diǎn)附近做層厚10μm冰凍切片，進(jìn)行BDNF免疫組織化學(xué)(一抗:兔抗BDNF抗體;二抗:羊抗兔 IgG)。DAB顯色 5min，蘇木素復(fù)染2min，染色后進(jìn)行脫水、透明、封片。以PBS作為陰性對照。

1．2．6 Western blot法檢測p75 檢測各組AD大鼠的行為學(xué)能力后，采用10%水合氯醛腹腔注射(6ml/kg)過量麻醉致死后取腦，分離海馬區(qū)的組織并用預(yù)冷的PBS洗滌后加細(xì)胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)定量后，將蛋白濃度調(diào)整為一致。加等量的3×SDS上樣緩沖液，配制12%的聚丙烯酰胺分離膠，每孔上樣50μg蛋白，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1h后，加入相應(yīng)的一抗4℃孵育過夜，以GAPDH作內(nèi)參照。洗滌3次，加入相應(yīng)二抗，37℃孵育1h，洗膜3次，用ECL發(fā)光法檢測目的條帶的表達(dá)。采用Image J分析軟件對目的條帶進(jìn)行分析。

1．3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17．0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，多組均數(shù)之間的兩兩比較采用單因素方差分析，P＜0．05有統(tǒng)計學(xué)意義，計量數(shù)據(jù)用數(shù)據(jù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2．1 3組行為學(xué)評分 3組Y迷宮的行為學(xué)評分結(jié)果顯示BDNF-NSC組較NSC組和溶劑對照組具有更少的嘗試次數(shù)，并且單因素方差分析顯示這種差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=31．62，P＜0．05);比較NSC組和Vehicle組行為學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSC組嘗試的次數(shù)亦明顯少于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)(見表 1)。

2．2 BDNF修飾的神經(jīng)干細(xì)胞在AD大鼠腦中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示BDNF修飾的神經(jīng)干細(xì)胞移植組大鼠在海馬可見較多的棕黃色陽性細(xì)胞，主要分布在海馬CA1、CA3區(qū)多形層和分子層及齒狀回，呈點(diǎn)狀沿多形層和分子層長軸分布(見圖1C)。而NSC和Vehicle組則末顯示明顯的陽性細(xì)胞(見圖1A、B)。

2．3 Western blot檢測p75蛋白在各組中的表達(dá) 在BDNF-NSC和NSC移植4w后，Western blot檢測結(jié)果顯示p75蛋白在BDNF-NSC和NSC移植組的表達(dá)明顯降低，而以BDNF-NSC降低的較為明顯。與BDNF-NSC和NSC移植組相比，Vehicle組顯示了更高的p75表達(dá)(見圖2)。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示BDNF-NSC移植組與NSC移植組和Vehicle組在p75蛋白的表達(dá)上具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0．05)。同時，NSC移植組和Vehicle組兩組在p75蛋白表達(dá)上也有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0．05)(見圖3)。

表1 3組AD大鼠空間學(xué)習(xí)能力與再現(xiàn)記憶能力的比較(±s)

表1 3組AD大鼠空間學(xué)習(xí)能力與再現(xiàn)記憶能力的比較(±s)

組別 例數(shù) 空間學(xué)習(xí)能力(s) 記憶再現(xiàn)能力(s)BDNF-NSC組NSC組對照組12 12 12 61．22 ±3．58 70．43 ±4．51 86．67 ±5．79 6．45 ±2．10 8．99 ±4．06 17．53 ±6．60

圖1 BDNF-NSC在3組AD大鼠腦中的表達(dá)(×100)

圖2 p75蛋白在各組中的表達(dá)

圖3 p75蛋白表達(dá)的統(tǒng)計分析與其他兩組比較有統(tǒng)計學(xué)差異*P＜0．05

3 討論

本實驗結(jié)果顯示經(jīng)BDNF修飾過的神經(jīng)干細(xì)胞能夠顯著提高AD大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，同時研究發(fā)現(xiàn)BDNF-NSC抑制了p75的表達(dá)。這些結(jié)果提示BDNF-NSC發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用，而這種保護(hù)作用可能是通過抑制p75的表達(dá)來實現(xiàn)的。

AD是一種常見的老年性疾病，該病的標(biāo)志性病理變化是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)和前腦、海馬內(nèi)出現(xiàn)斑塊，β淀粉蛋白(Aβ)是該斑塊的主要成份。大量研究顯示無論Aβ的單體還是多聚體都是可以對腦神經(jīng)產(chǎn)生損害作用，而另一些研究表明Aβ的神經(jīng)損害作用是與 p75的功能密切相關(guān)［8～10］。p75是一種具有多功能的腫瘤壞死因子超家族受體，它的功能與細(xì)胞凋亡、分化與存活有關(guān)［11］。最近研究表明p75經(jīng)常作為Aβ受體來凋節(jié)Aβ的神經(jīng)毒性作用。Aβ與p75結(jié)合后引起了下游的炎癥信號通路的改變，如JNK、NFKβ和PI3K等，從而造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷［12，13］。另有文獻(xiàn)報道表達(dá)p75的細(xì)胞對Aβ的毒性的敏感程度顯著增加［14］。這些研究均提示在AD的過程中，p75發(fā)揮了主要的神經(jīng)損害作用，因此，我們將BDNF-NSC對p75表達(dá)的抑制效果作為判斷療效的標(biāo)準(zhǔn)。

神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)是一種具有分化潛能的原始細(xì)胞，由于其具備自我更新和增殖的能力，并在特定因素影響或誘導(dǎo)下向神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞分化，所以近些年來成為許多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。國外有研究發(fā)現(xiàn)將人來源的神經(jīng)干細(xì)胞移植入腦出血的小鼠體內(nèi)，神經(jīng)干細(xì)胞可分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，從而使該小鼠的神經(jīng)功能得到顯著改善［15］。國內(nèi)學(xué)者吳樹亮研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)移植的神經(jīng)干細(xì)胞不僅可以提高AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，而且可減少海馬中老年斑的沉積和神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成［16］。另外，有文獻(xiàn)報道BDNF對神經(jīng)元的生長、分化及損傷后修復(fù)有促進(jìn)作用，而且BDNF可以抑制AD大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞從有絲分裂G2期向M期的轉(zhuǎn)換，從而抑制了由4倍體神經(jīng)元引起的凋亡［17］。然而經(jīng)BDNF修飾的神經(jīng)干細(xì)胞是否對AD中p75的表達(dá)具有抑制作用目前尚未見相關(guān)的報道。

因此，為了檢測BDNF-NSC在AD中的作用及作用機(jī)制，我們將BDNF-NSC采用立體定向注射的方法注入AD大鼠腦內(nèi)，然后通過Y迷宮試驗來評定3組AD大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。評定結(jié)果顯示BDNF-NSC組和NSC組較Vehicle組具有更好的行為學(xué)評分，而且BDNF-NSC組較NSC組在行為學(xué)上改善更為明顯，這些結(jié)果表明BDNF-NSC不僅具有保護(hù)神經(jīng)元免受Aβ?lián)p傷的作用。同時為了證明BDNF-NSC的存在，為了證實行為學(xué)的改善是由于BDNF-NSC作用的結(jié)果，我們檢測了BDNF-NSC的表達(dá)，免疫組織化學(xué)的檢測結(jié)果顯示BDNF-NSC大量存在于海馬的顆粒細(xì)胞層。海馬顆粒層神經(jīng)細(xì)胞與空間學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)，免疫組織化學(xué)的結(jié)果間接證明了AD大鼠行為學(xué)的改善是BDNF-NSC移植造成的結(jié)果。為了進(jìn)一步揭示BDNF-NSC作用機(jī)制，我們檢測了3組海馬區(qū) p75蛋白的表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示BDNF-NSC組的p75蛋白表達(dá)較NSC組和Vehicle組明顯降低，并且有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。這一結(jié)果提示BDNF-NSC可能通過抑制p75的表達(dá)起到神經(jīng)保護(hù)作用，當(dāng)然，具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

總之，我們的實驗提示BDNF-NSC通過抑制p75的表達(dá)起到了神經(jīng)保護(hù)的作用，從而提高了AD大鼠的行為學(xué)能力。該研究可能為AD的治療提供新的途徑和靶點(diǎn)，可能為進(jìn)一步研究AD的治療方法提供理論依據(jù)。

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