丁苯酞預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用

殷 雁， 辛世萌

缺血性腦血管病是神經系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病。腦缺血再灌注損傷是多數缺血性腦血管疾病的主要病理生理過程，其中主要的發(fā)病機制之一是細胞凋亡［1，2］。caspase-3 是一種凋亡執(zhí)行因子［3］，在缺血缺氧的條件下起到誘導細胞凋亡的作用。而bcl-2基因是bcl-2家族的一員，已有研究表明，其在體外能夠抑制神經元凋亡［4］，可在缺血缺氧所造成的神經細胞損傷中起保護作用。丁苯酞(商品名為恩必普NBP)，是我國第一個擁有自主知識產權的國家Ⅰ類化學新藥，其通過阻斷缺血性腦卒中所致腦損傷的多個病理環(huán)節(jié)起作用，可改善腦能量代謝和缺血腦區(qū)的微循環(huán)和血流量，用于治療輕、中度急性缺血性腦卒中。本實驗應用藥物預處理的方法，通過對腦梗死體積及凋亡相關因子的檢測，觀察丁苯酞在神經保護方面的作用。

1 材料和方法

1．1 實驗動物分組 健康成年SD雄性大鼠48只，大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供，體重200～250g，清潔級，室溫環(huán)境飼養(yǎng)，自由進食水。隨機分為假手術組、缺血再灌注組、丁苯酞預處理組，每組各16只。

1．2 主要試劑 丁苯酞軟膠囊(0．2克/粒，石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司);兔抗大鼠caspase-3和bcl-2抗體(Bioworld technology公司);SP試劑盒和DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1．3 方法

1．3．1 預處理 丁苯酞預處理組于術前5d開始用丁苯酞溶劑(以丁苯酞膠囊溶于生理鹽水配成10mg/ml混懸液，用前充分搖勻)以50mg/kg/d的劑量進行灌胃。其余兩組相應給予等體積生理鹽水。

1．3．2 MCAO 模型的制備 線栓法［5］制作右側大腦中動脈栓塞(MCAO)模型:SD大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(0．35ml/100g)，背部固定后，頸部剪毛消毒，取頸正中切口，鈍性分離右側頸總動脈(CCA)，頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)并掛線備用，結扎CCA和ECA，用動脈夾夾閉ICA遠心端后，迅速于ICA上做一切口，從切口插入備好的魚線，魚線插入ICA后，打開夾閉ICA的動脈夾，輕柔送線接近18mm處，感覺有阻力時停止，固定拴線。缺血2h后拔除魚線實施再灌注24h。假手術組僅暴露右側頸總動脈，不做其余處理。

1．3．3 神經功能缺損評分 (按 Zea Long［5］5分制標準評分)于大鼠腦缺血再灌注1h后進行。0分:無神經損傷癥狀;1分:不能完全伸展對側前爪;2分:向對側轉圈;3分:向對側傾倒;4分:不能自發(fā)行走，意識喪失;5分:死亡。其中評分為1～3分且無蛛網膜下腔出血的大鼠進入實驗，0分、4分和5分剔除，并隨機補充。

1．3．4 腦梗死體積測定 模型制備成功后，假手術組在手術后2h，其余各組在達到各再灌注時間點24h時，每組各隨機取8只大鼠，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，其余用排刀冠狀切成5片，每片厚度約2mm，置于 2%TTC(2%氯化-2，3，5-三苯基四氮唑)溶液中，37℃避光染色30min，4%多聚甲醛液中固定24h后用數碼相機照相，正常組織為紅色，梗死灶為白色，利用圖像分析法計算各個腦片梗死面積，計算梗死體積。

1．3．5 標本及切片的制備 模型制備成功后，假手術組在手術后2h，其余各組在達到各再灌注時間點24h時，每組各隨機取8只大鼠，經10%水合氯醛(0．35ml/100g)腹腔麻醉，打開胸腔，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛各200ml進行心臟(左心室)灌流固定，至流液透明，斷頭取腦。在右側大腦半球距離嗅球尖端7～11mm之間冠狀切取約2mm厚腦組織塊，置入4%多聚甲醛液中固定24h，進行脫水、透明、包埋成蠟塊，連續(xù)切片5張，每張厚約5μm。

1．3．6 免疫組織化學染色(SP法) 腦片經常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后-3%過氧化氫37℃20min，0．01mol/L PBS 沖洗3 ×3min-抗原修復-0．01 mol/L PBS沖洗3×3min，10%正常山羊血清37℃封閉15min-分別加入兔抗大鼠 caspase-3和 bcl-2一抗，4℃過夜，次日 0．01mol/L PBS沖洗 3×3min-滴加生物素標記的羊抗兔二抗，37℃，20min，0．01mol/L PBS沖洗3×3min-滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，37℃，20min，0．01mol/L PBS 沖洗 3 ×3min-3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色 10 ～20min，流水沖洗，蘇木復染，終止反應，脫水后封片劑封片。陰性對照用0．01mol/L PBS和山羊血清代替一抗。在光鏡下觀察胞漿呈棕黃染色的陽性細胞，于陽性細胞分布區(qū)隨機選擇5個不重復的視野，計算caspase-3、bcl-2陽性細胞的百分率。

1．4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13．0系統(tǒng)進行數據分析處理，所有結果用均數±標準差(±s)表示，神經功能缺損評分用Wilcoxon法秩和檢驗，組間比較用成組設計的t檢驗，檢測指標在組間表達的變化用單因素方差分析。P保留小數點后3位，P＜0．05表示差異有顯著的統(tǒng)計學意義，P＜0．01表示差異有非常顯著的統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 神經功能缺損評分 腦缺血2h再灌注24h后大鼠神經功能缺損主要表現為左前肢屈曲，肌張力降低，側推阻力降低，活動減少，向左側追尾轉圈，伴或不伴有右側Horner征。假手術組無神經缺損，評分為0;丁苯酞預處理后缺血再灌注組神經缺損程度明顯改善，低于缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)(見表1)。

2．2 腦梗死體積測定(TTC染色) 假手術組腦組織呈均勻紅色無梗死灶;與缺血再灌注組相比，丁苯酞預處理后缺血再灌注組梗死灶體積減少(見圖1～3)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)(見表2)。

2．3 免疫組化檢測

2．3．1 caspase-3表達 假手術組 caspase-3陽性細胞僅少量表達，缺血再灌注組caspase-3陽性細胞數量較多，與缺血再灌注組相比，丁苯酞預處理后缺血再灌注組caspase-3陽性細胞數量減少(見圖4～6)，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)(見表3)。

2．3．2 bcl-2表達 假手術組 bcl-2僅少量表達，缺血再灌注組bcl-2表達較假手術組增加，與缺血再灌注組相比，丁苯酞預處理后缺血再灌注組bcl-2表達上調(見圖7～9)，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)(見表4)。組別 例數 神經功能缺失評分(分)

表1 腦缺血再灌注后神經功能缺損評分(±s)

表1 腦缺血再灌注后神經功能缺損評分(±s)

與假手術組相比*P＜0．01;與缺血再灌注組相比＊＊P＜0．05

假手術組缺血再灌注組丁苯酞預處理組16 16 16 0．00 ±0．00 2．19 ±0．98*1．50 ±0．52＊＊

表2 腦缺血再灌注后腦梗死體積的比較(±s)

表2 腦缺血再灌注后腦梗死體積的比較(±s)

與假手術組相比*P＜0．01;與缺血再灌注組相比＊＊P＜0．05

組別 例數 腦梗死體積(mm3)假手術組缺血再灌注組丁苯酞預處理組16 16 16 0．00 ±0．00 97．26 ±2．09*94．64 ±1．75＊＊

表3 各組腦組織內caspase-3表達陽性率的比較(±s)

表3 各組腦組織內caspase-3表達陽性率的比較(±s)

與假手術組相比*P＜0．01;與缺血再灌注組相比＊＊P＜0．05

組別 例數 caspase-3陽性率(%)假手術組缺血再灌注組丁苯酞預處理組16 16 16 10．81 ±0．60 67．12 ±1．47*66．16 ±0．96＊＊

表4 各組腦組織內bcl-2表達陽性率的比較(±s)

表4 各組腦組織內bcl-2表達陽性率的比較(±s)

與假手術組相比*P＜0．01;與缺血再灌注組相比＊＊P＜0．05

假手術組缺血再灌注組bcl-2陽性率(%)16 16 16 5．62 ±0．34 60．25 ±0．87*60．74 ±0．58＊＊

圖1 假手術組

圖2 缺血再灌注組

圖3 丁苯酞預處理組

圖4 假手術組

圖5 缺血再灌注組

圖6 丁苯酞預處理組

圖7 假手術組

圖8 缺血再灌注組

3 討論

缺血性卒中對腦有破壞性作用，事實上，每分鐘腦缺血可以損害大約190萬個神經元和140億個突觸［6］。目前研究認為，缺血性神經元的壞死與凋亡，共同參與缺血性腦損傷的形成［7］。局灶性腦缺血形成后，病灶分為兩個區(qū)域，中心區(qū)主要以細胞死亡為主，中心區(qū)周圍為缺血半暗帶區(qū)，主要以細胞凋亡為主。腦缺血后神經損傷的形成過程主要有細胞凋亡參與，如能有效阻止細胞凋亡，即可減輕腦組織的損傷程度。在神經系統(tǒng)，現已知與凋亡相關的基因可分為兩大類［8］:一類起促進細胞凋亡的作用，如caspase-3等;另一類起抑制細胞凋亡的作用，如bcl-2等。

caspase-3是caspase級聯(lián)瀑布下游最關鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶［9，10］，不僅是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的必經之路，也是凋亡的關鍵酶和執(zhí)行者［11，12］，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用。caspase-3除了在凋亡中的關鍵作用以外，其在各種生物進程如細胞分化、粘附、神經發(fā)育和神經信號等方面起到至關重要的調節(jié)作用［13～15］。研究表明［16］，caspase-3能夠在動物缺血性發(fā)作模型中激活。在凋亡神經細胞中，caspase-3是重要的執(zhí)行者，能夠通過內外兩條信號通道激活［17］。Schmidt-Kastner R等［18］在大鼠短暫局部缺血腦組織中檢測到 caspase-3 mRNA。Fink K 等研究發(fā)現［19］，caspase激活發(fā)生在MCAO后9h，且caspase抑制劑能減弱缺血再灌注損傷。重要的是，Rami A等［20］也發(fā)現，人腦缺血后caspase-3在腦組織中上調。這些研究提示，caspase-3可能是缺血發(fā)作中凋亡的重要媒介物［21］。本實驗結果顯示:丁苯酞預處理組的神經功能缺損程度較缺血再灌注組明顯改善，腦梗死體積較之缺血再灌注組明顯減小，可見丁苯酞的應用明顯改善了腦缺血的神經損傷程度。缺血再灌注組、丁苯酞預處理組caspase-3陽性細胞數量均有增加，其表達主要位于病灶側的缺血區(qū)域內，印證了caspase-3的激活在缺血缺氧誘導的細胞凋亡過程中的作用;丁苯酞預處理組caspase-3表達陽性率較之缺血再灌注組明顯減少，可見丁苯酞可能是通過抑制細胞凋亡這一途徑發(fā)揮神經保護作用。

bcl-2是bcl-2家族中的一員，是最早發(fā)現的功能最為明確的抗細胞凋亡基因之一，其編碼的bcl-2蛋白是一種重要的內源性抗凋亡因子［22］。bcl-2的抗凋亡作用是通過預防細胞色素C釋放入細胞質中來實現的［23］。許多研究表明，過度表達bcl-2能夠減少卒中動物模型中缺血性腦損傷［24，25］。其主要作用是抑制細胞凋亡，是神經系統(tǒng)的主要神經保護性蛋白，其表達越多，腦保護作用越強［26］。本實驗中bcl-2的表達在丁苯酞預處理組較缺血再灌注組明顯上調，印證了bcl-2在細胞凋亡途徑的關鍵環(huán)節(jié)上起到抑制凋亡的作用，減輕了缺血再灌注損傷;也說明了丁苯酞能夠通過增加抗凋亡蛋白的表達發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用，從而減輕缺血再灌注后的神經系統(tǒng)損傷。

本實驗得出丁苯酞預處理對腦缺血再灌注損傷的保護機制可能是:(1)抑制促凋亡因子的產生，同時促進抗凋亡因子的產生，那么在發(fā)生腦缺血時，能夠促進細胞凋亡的因子數量則比正常組織少，而保護細胞防止其凋亡的因子數量比正常組織多，從而達到減少細胞凋亡、增強保護作用的目的，起到神經保護作用;(2)在發(fā)生腦缺血時，使原有的再灌注能力增強，從而更好地修復受損的神經功能，達到神經保護的作用。

丁苯酞預處理可明顯改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷所致的神經功能缺損情況，并減少腦組織的梗死體積，具有一定的神經保護作用;其神經保護作用可能與上調bcl-2的表達、抑制caspase-3的表達有關，可見腦缺血藥物預處理可以通過抑制細胞凋亡而起神經保護作用。這就為臨床上缺血性腦血管疾病的預防治療提供了新思路，可能給廣大腦缺血疾病患者提供更多的用藥選擇，可能為我國自主研發(fā)的新藥提供更為廣闊的應用平臺。

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