復(fù)方雙氯芬酸辣椒巴布貼微生物限度檢查方法的驗(yàn)證

王 薇，鄭漢平，廖祥茹

復(fù)方雙氯芬酸辣椒巴布貼含有雙氯芬酸二乙胺、辣椒堿、冰片等，有較強(qiáng)的抗菌作用。依據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版［1］，本文采用薄膜過(guò)濾法對(duì)復(fù)方雙氯芬酸辣椒巴布貼進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)的驗(yàn)證，去除其抑菌成分，使加菌回收達(dá)到滿意的效果。

1 驗(yàn)證材料

1.1 樣品 復(fù)方雙氯芬酸辣椒巴布貼:規(guī)格: 1%，批號(hào):20090118、20090510、20091115，廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科制劑室生產(chǎn)。

1.2 儀器 HTY-2000集菌儀、可拆卸式薄膜過(guò)濾器(杭州高得醫(yī)療器械有限公司)，微孔濾膜:孔徑0.45 μm(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司)，SW-CJ-IFD/T型潔凈工作臺(tái)、BSC-1300ⅡA2型生物安全柜(蘇凈集團(tuán)安泰公司生產(chǎn))，PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.3 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):101130)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):100114)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào):101213)、膽鹽乳糖增菌液(批號(hào): 091029)、改良馬丁培養(yǎng)基(批號(hào):1010122)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):081219)，北京三藥科技開發(fā)公司，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20090713)，蛋白胨(天津市英博生化試劑有限公司，批號(hào): 051209)。

1.4 稀釋劑 pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，按中國(guó)藥典2010年版二部附錄方法配制。

1.5 菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44102］第4代，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］第4代，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］第4代，白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F) 98001］第3代，黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC (F)98003］第4代，銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)［CMCC(B)10104］第3代。

2 菌液制備方法

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24 h，分別取上述培養(yǎng)物1 mL，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9 mL，10倍遞增稀釋制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，置23～28℃培養(yǎng)24～48 h，取培養(yǎng)物1 mL，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9 mL，10倍遞增稀釋制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液;接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，置23～28℃培養(yǎng)5～7 d，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，取原液1 mL，加含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9 mL，10倍遞增稀釋制成每1 mL含孢子數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液。

3 供試液制備

取樣品100 cm2，去掉貼劑的保護(hù)層，置于無(wú)菌玻璃片上，粘貼面朝上。用無(wú)菌紗布覆蓋貼劑的粘貼面，避免貼劑粘貼在一起。將其置于適宜體積并含有聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，用力振蕩至少30 min，作為1∶10供試液，備用。

4 菌落計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

4.1 常規(guī)平皿法、培養(yǎng)基稀釋法

4.1.1 試驗(yàn)組 取1∶10供試液1、0.5 mL與各試驗(yàn)菌液(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)1 mL，分別注入平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，分別置30～35℃培養(yǎng)3 d、23～28℃培養(yǎng)5 d，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。

4.1.2 菌液組 分別取上述稀釋的試驗(yàn)菌液1 mL注入平皿內(nèi)，每種試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

4.1.3 供試品對(duì)照組 取1∶10供試液1 mL，按“4.1.1”項(xiàng)下操作，不加菌液，測(cè)定供試品的本底菌數(shù)。

4.1.4 稀釋劑對(duì)照組 取稀釋劑1 mL，按“4.1.1”項(xiàng)下操作。

4.1.5 結(jié)果 見表1、表2?？梢姵Ｒ?guī)平皿法3次試驗(yàn)5株菌株均受到了不同程度抑制，而用培養(yǎng)基稀釋法每皿0.5 mL，部分菌仍受到抑制，說(shuō)明常規(guī)平皿法和培養(yǎng)基稀釋法均不能有效去除其抑菌成分，須重新建立細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證。

表1 常規(guī)平皿法回收率測(cè)定結(jié)果(%)

表2 培養(yǎng)基稀釋法回收率測(cè)定結(jié)果(%)

4.2 薄膜過(guò)濾法

4.2.1 試驗(yàn)組 取1∶10供試液10 mL加入含100 mL稀釋液的薄膜過(guò)濾器中全量過(guò)濾，用沖洗液(100 mL/次)沖洗4次。在最后一次加入1 mL (50～100 cfu)各試驗(yàn)菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)，取出濾膜，菌面朝上貼于已制備的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，平行制備2皿，置30～35℃培養(yǎng)3 d或23～28℃培養(yǎng)5 d。逐日觀察，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。

4.2.2 菌液組 分別取上述試驗(yàn)菌液1 mL注入薄膜過(guò)濾器內(nèi)過(guò)濾，貼膜。每種菌平行制備2張濾膜，分別測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

4.2.3 供試品對(duì)照組 取1∶10供試液10 mL，按“4.2.1”項(xiàng)下操作，不加菌液，測(cè)定樣品本底數(shù)。

4.2.4 稀釋劑對(duì)照組 取稀釋劑1 mL，按“4.2.1”項(xiàng)下操作。重復(fù)試驗(yàn)3次。

4.2.5 結(jié)果 見表3。由表3可見，用400 mL沖洗時(shí)，各試驗(yàn)菌株的回收率均達(dá)70%以上。說(shuō)明薄膜過(guò)濾法可用于復(fù)方雙氯芬酸辣椒巴布貼的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)，沖洗量定為400 mL。

表3 薄膜過(guò)濾法回收率測(cè)定結(jié)果(%)

5 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

5.1 銅綠假單胞菌檢查方法驗(yàn)證

5.1.1 試驗(yàn)組 取1∶10的供試液10 mL及銅綠假單胞菌菌液1 mL，接種至200 mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基內(nèi)，于35℃培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24 h，按相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。

5.1.2 陰性菌對(duì)照組 取1∶10的供試液10 mL及大腸埃希菌菌液1 mL，接種至200 mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基內(nèi)，方法同“5.1.1”項(xiàng)。

5.1.3 結(jié)果 見表4。由表4可見，試驗(yàn)組檢出銅綠假單胞菌，陰性菌對(duì)照組未檢出大腸埃希菌。說(shuō)明200 mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基可以用于復(fù)方雙氯芬酸辣椒巴布貼銅綠假單胞菌的檢查。

表4 控制菌銅綠假單胞菌驗(yàn)證結(jié)果

5.2 金黃色葡萄球菌檢查方法驗(yàn)證

5.2.1 試驗(yàn)組 取1∶10的供試液10 mL及金黃色葡萄球菌菌液1 mL，接種至300 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，于35℃培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)物，劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24～72 h，按相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。

5.2.2 陰性菌對(duì)照組 取1∶10的供試液10 mL及大腸埃希菌菌液1 mL，接種至300 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，方法同“5.2.1”項(xiàng)。

5.2.3 結(jié)果 見表4。試驗(yàn)組檢出金黃色葡萄球菌，陰性菌對(duì)照組未檢出大腸埃希菌。說(shuō)明300 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基可以用于復(fù)方雙氯芬酸辣椒巴布貼金黃色葡萄球菌的檢查。

6 討論

6.1 稀釋劑對(duì)照組的菌回收率均大于70%，說(shuō)明采用含適量聚山梨酯80的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液對(duì)試驗(yàn)不產(chǎn)生干擾。

6.2 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)采用薄膜過(guò)濾法，取1∶10供試液10 mL加入含100 mL稀釋液的薄膜過(guò)濾器中全量過(guò)濾，用沖洗液(100 mL/次)沖洗4次。此法可有效去除復(fù)方雙氯芬酸辣椒巴布貼的抑菌成分?？刂凭鷻z查采用培養(yǎng)基稀釋法，取1∶10的供試液10 mL分別接種至200 mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基或300 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，依法進(jìn)行檢查。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)［S］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:附錄107-116.