風(fēng)濕免疫臨床實(shí)驗(yàn)的實(shí)習(xí)教學(xué)體會(huì)

張文蘭 胡同平 (包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，包頭014010)

風(fēng)濕免疫病學(xué)是一門較新的臨床醫(yī)學(xué)學(xué)科，起步較晚，人們對(duì)風(fēng)濕免疫性疾病的認(rèn)識(shí)尚淺，易引起漏診、誤診。風(fēng)濕免疫性疾病指主要侵犯關(guān)節(jié)、肌肉、骨骼及關(guān)節(jié)周圍的軟組織，如肌腱、韌帶、滑囊、筋膜等部位的病。在臨床實(shí)驗(yàn)的實(shí)習(xí)帶教中，筆者認(rèn)為應(yīng)從以下四個(gè)方面讓學(xué)生對(duì)風(fēng)濕免疫有更全面的了解。

1 要讓學(xué)生了解風(fēng)濕免疫性疾病的范疇和分類[1]

風(fēng)濕免疫性疾病是一組疾病，包括彌漫性結(jié)締組織病(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、硬皮病、多肌炎、重疊綜合征、血管炎等)、脊柱關(guān)節(jié)病(強(qiáng)直性脊柱炎、Reiter綜合征、銀屑病關(guān)節(jié)炎、未分化脊柱關(guān)節(jié)病等)、退行性變?nèi)缭l(fā)性和/或繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎、與代謝和內(nèi)分泌相關(guān)的風(fēng)濕病(痛風(fēng)、假性痛風(fēng)、馬方綜合征、免疫缺陷病等)、和感染相關(guān)的風(fēng)濕病(反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕熱等)、腫瘤相關(guān)的風(fēng)濕病(原發(fā)性的滑膜瘤、滑膜肉瘤等，繼發(fā)性的多發(fā)性骨髓瘤、轉(zhuǎn)移瘤等)、神經(jīng)血管疾病(神經(jīng)性關(guān)節(jié)病、周圍神經(jīng)受壓和/或神經(jīng)根受壓等引起的壓迫性神經(jīng)病變、雷諾病等)、骨與軟骨病變(骨質(zhì)疏松、骨軟化、肥大性骨關(guān)節(jié)病、彌漫性原發(fā)性骨肥厚、骨炎等)、非關(guān)節(jié)性風(fēng)濕病(關(guān)節(jié)周圍病變、椎間盤病變、特發(fā)性腰痛、其他痛綜合征如精神性風(fēng)濕病等)、其他有關(guān)關(guān)節(jié)癥狀的疾病如周期性風(fēng)濕病、間歇性關(guān)節(jié)積液、藥物相關(guān)的風(fēng)濕綜合征、慢性活動(dòng)性肝炎等。

2 要讓學(xué)生對(duì)風(fēng)濕免疫性疾病的自身抗體有全面的了解

隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，出現(xiàn)了越來越多的自身抗體。這些自身抗體的出現(xiàn)，對(duì)于風(fēng)濕免疫性疾病的診斷和鑒別診斷，起到了非常重要的作用。

2.1 抗核抗體 抗核抗體(Antinuclear antibodies，ANA)是抗細(xì)胞核抗原成分的自身抗體的總稱，是一組針對(duì)細(xì)胞核內(nèi)DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂類、酶類或這些物質(zhì)的分子復(fù)合物的抗體。已證實(shí)，ANA對(duì)很多自身免疫性疾病有診斷價(jià)值。在不同疾病中，特別是風(fēng)濕免疫性疾病，其抗體譜有一定的特異性。在炎癥性風(fēng)濕病中ANA陽性率在20% ～100%，其中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中ANA陽性率最低，為20% ～40%[2]。因而，檢測(cè)ANA對(duì)于不同類型風(fēng)濕病意義重大[3]。目前，ANA檢測(cè)已成為臨床上的一個(gè)極重要的自身免疫病的篩查實(shí)驗(yàn)。

2.2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)免疫標(biāo)志物 用于診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，除了傳統(tǒng)的類風(fēng)濕因子外，最近幾年，又出現(xiàn)了抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(CCP)、抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗體(AKA)、抗RA33抗體、抗突變型瓜氨酸波形蛋白抗體(MCV)等更敏感、更特異的診斷指標(biāo)。

2.3 系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)免疫標(biāo)志物 抗雙鏈DNA抗體、抗單鏈DNA抗體、抗Sm抗體、抗組蛋白抗體、抗核小體抗體對(duì)于SLE的診斷和鑒別診斷也起到了非常重要的作用，特別是抗核糖體P蛋白抗體對(duì)于狼瘡腦病診斷有非常高的特異性。

2.4 干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome，SS)相關(guān)免疫標(biāo)志物 SS是常見的自身免疫紊亂疾病，它的特征是淚腺和唾液腺的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致角膜結(jié)膜炎和口腔干燥。盡管對(duì)SS的分類、癥狀、眼睛和口的干燥程度已有較完善的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但結(jié)果并不理想。另外，對(duì)眼淚和唾液的測(cè)定缺乏靈敏度和特異性，即使是口腔唾液腺的活組織檢查，靈敏度也只有80%。而抗α-胞襯蛋白(α-fodrin)多肽抗體是從人類SS模型NFS/sld小鼠唇腺中提取的涎腺特異性自身抗體，是一種與細(xì)胞架構(gòu)有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白，被認(rèn)定為SS的敏感的和特異的標(biāo)記物[4]。

2.5 其他自身抗體 皮肌炎、多肌炎和包涵體肌炎都是原發(fā)性、未知病因?qū)W的炎癥疾病，具有肌無力和近端肌肉組織萎縮的特征。而抗JO-1抗體、抗PMScl-100抗體、抗PL-7抗體、抗PL-12抗體、抗Mi-2抗體、抗Ku(p78/80)抗體、抗SRP抗體等這些肌炎特異性自身抗體和肌炎相關(guān)性自身抗體的檢測(cè)，對(duì)于肌炎的診斷和鑒別診斷起到了畫龍點(diǎn)睛的作用。

因此，讓學(xué)生全面了解各種疾病的特異性和相關(guān)性自身抗體是非常必要的。

3 要讓學(xué)生對(duì)常見自身抗體的檢測(cè)方法有所了解

因?yàn)槭桥R床實(shí)驗(yàn)的實(shí)習(xí)，所以各種實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)原理和檢測(cè)方法是學(xué)生們要重點(diǎn)掌握的內(nèi)容。從上面的內(nèi)容可以看出，風(fēng)濕免疫性疾病種類很多，用于風(fēng)濕免疫性疾病的診斷和鑒別診斷的自身抗體也有很多。從我們科風(fēng)濕免疫實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在已經(jīng)開展的項(xiàng)目來看，檢測(cè)方法歸納起來主要有以下四種。

3.1 間接免疫熒光法(Indirect Immunofluorescence，IIF) 用特異性抗體與標(biāo)本中相應(yīng)抗原反應(yīng)，再用熒光素標(biāo)記的第二抗體(抗抗體)與抗原抗體復(fù)合物中第一抗體結(jié)合，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察特異性熒光，以檢測(cè)未知抗原或抗體。本實(shí)驗(yàn)室主要用于 ANA、APF、AKA和抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)的檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)是形象、直觀，一目了然地觀察結(jié)果，但缺點(diǎn)是只能定性，或者半定量，而且結(jié)果容易受觀察者主觀因素的影響。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)[5]其基本原理是把抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性;并將抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)記抗原或抗體，它既保留了免疫活性，又保留了酶的活性;測(cè)定時(shí)將受檢樣品(含待檢抗原或抗體)和酶標(biāo)記抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物;用洗滌的方法將固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例;加入底物后，底物被固相載體上的酶催化變成有色產(chǎn)物，通過定性或定量檢測(cè)有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)含量。由于酶催化效率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的靈敏度。本實(shí)驗(yàn)室開展的類風(fēng)濕因子分型(RF-IgA/G/M)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(CCP)、抗RA33抗體、抗dsDNA抗體、抗核小體抗體、抗線粒體抗體M2型、抗α-胞襯蛋白多肽抗體都是采用的ELISA法，而且都是定量檢測(cè)。

3.3 免疫印跡法(Immunoblot Test，IBT) 是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原抗體檢測(cè)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)，將SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨力與抗原抗體反應(yīng)的高特異性相結(jié)合。臨床上抗核提取物抗體(ENA)的測(cè)定最常使用的方法就是IBT。

3.4 速率散射比濁法(Rate Nephelometry) 是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)測(cè)定法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時(shí)間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量，連續(xù)測(cè)定各單位時(shí)間內(nèi)復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號(hào)聯(lián)系在一起，形成動(dòng)態(tài)的速率散射比濁法，每項(xiàng)檢測(cè)僅1～2分鐘即可完成。本實(shí)驗(yàn)室開展的免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgE、IgG4)、補(bǔ)體(C3、C4)、抗鏈球菌溶血素O、抗鏈球菌DNA酶、C-反應(yīng)蛋白、類風(fēng)濕因子的測(cè)定均使用西門子的BNP特種蛋白儀，采用速率散射比濁法全自動(dòng)定量檢測(cè)。操作簡(jiǎn)單，只需要將標(biāo)本放入樣品盤，在電腦上發(fā)出指令就行，并且能很快得到結(jié)果，能為臨床提供及時(shí)、準(zhǔn)確的報(bào)告。

4 要讓學(xué)生熟悉實(shí)驗(yàn)的全程操作，讓每位學(xué)生都親自動(dòng)手參與實(shí)驗(yàn)的每一個(gè)步驟與環(huán)節(jié)

學(xué)生對(duì)于實(shí)驗(yàn)的全過程有了深刻的了解，這樣在今后的獨(dú)立工作中，就可以把握好每一個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，養(yǎng)成縝密的思維習(xí)慣，為他們以后完成自己的工作打好基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)之前，要讓學(xué)生明白一個(gè)基本思路，那就是免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)過程中，要充分發(fā)揮學(xué)生的積極性和技巧性。每個(gè)人要獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)，其目的是訓(xùn)練正確、熟練的操作能力，養(yǎng)成良好的工作習(xí)慣，遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程，認(rèn)真觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，切忌走馬觀花。實(shí)驗(yàn)完成后，要認(rèn)真總結(jié)實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的問題，解答每一位學(xué)生提出的疑問，讓每位學(xué)生都弄懂弄通免疫指標(biāo)在臨床診斷的重要意義，為以后工作中合理、正確地解答病人和臨床醫(yī)生的疑問打下良好的基礎(chǔ)。

總之，通過風(fēng)濕免疫臨床實(shí)驗(yàn)的相關(guān)學(xué)習(xí)，讓學(xué)生對(duì)風(fēng)濕免疫性疾病的范疇和分類有更全面的了解，特別是對(duì)自身免疫性疾病常見的自身抗體及其檢測(cè)方法和操作過程會(huì)有更直觀、更直接、更感性的認(rèn)識(shí)。不管學(xué)生以后是從事臨床工作，還是從事實(shí)驗(yàn)室工作，相信這對(duì)他們以后的工作會(huì)有很大的幫助。

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4 Turkcapar N，Olmez U，Tutkak H et al．The importance of alpha-Fodrin antibodies in the diagnosis of Sj?gren’s syndrome[J].Rheumatol，2006;26(4):354-359.

5 王蘭蘭，吳健民.臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn)[M].第4版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:103-104.