不同濃度乙醇對2種大孔樹脂吸附的舒胸片中6種有效成分梯度洗脫能力

鐘露苗，莫美霞，夏新華

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙410208;2.湖南省藥品審評認(rèn)證與不良反應(yīng)監(jiān)測中心，湖南長沙410013;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南長沙410007)

舒胸片在《中國藥典》2010年版一部中也是收載品種［1］，由三七、紅花和川芎三味中藥組成，功效主治制備方法、日服劑量與《中國藥典》2005年版一部記載相同。為繼續(xù)探討該復(fù)方有效成分富集純化的方法，作者采用大孔樹脂吸附技術(shù)，選擇LSA-30、HPD-100兩種樹脂，在系統(tǒng)的動態(tài)吸附性能研究基礎(chǔ)上［2，8-9］，考察不同濃度梯度的乙醇對方中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、羥基紅花黃色素A、阿魏酸和川芎嗪［3-5］6種有效成分的洗脫能力。

1 儀器與試藥

1.1 儀器shimadzu LC-10Atvp型高效液相色譜儀;shimadzu SPD-10Avp型紫外檢測器;N3000色譜工作站。AY120 SHIMADZU分析天平。玻璃層析柱(內(nèi)徑1.5 cm)。

1.2 試藥與材料人參皂苷Rg1(批號:110703-200322，供含量測定用)、人參皂苷Rb1(批號:110704-200318，供含量測定用)、三七皂苷R1(批號:110745-200312)、川芎嗪(批號:110817-200305，供含量測定用)、阿魏酸(批號:07733-9910，供含量測定用)、羥基紅花黃色素A對照品(批號:111637-200502，供含量測定用)，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

乙腈為色譜純(Caledon Laboratories LTD.)，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

三七經(jīng)鑒定為五加科植物三七Panax Notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根莖;川芎經(jīng)鑒定為傘形科植物川芎Ligugsticum ChuanxiongHort.的干燥根莖;紅花經(jīng)鑒定為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。均由湖南三湘中藥飲片有限公司提供。

LSA-30型大孔吸附樹脂，由西安藍(lán)深交換吸附材料有限責(zé)任公司提供，HPD-100型大孔吸附樹脂由滄州寶恩化工有限公司提供。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 舒胸片提取液的制備按2010年版《中國藥典》舒胸片處方各藥味比例，制備同參考文獻(xiàn)［2］2.1項“取三七細(xì)粉，加50%乙醇浸泡2.5 h，回流提取2次，加醇量分別為藥材的8倍、6倍量，提取時間分別為2.5 h、2.0 h，收集醇提液，回收乙醇，備用;取川芎，加10倍量水煎煮2 h，濾過，濾液另存，藥渣與紅花加8倍量水煎煮2次，每次1 h，合并3次煎液，60℃減壓濃縮至每1 mL含1 g生藥，在攪拌下緩緩加入乙醇使含乙醇量達(dá)70%，靜置24 h，濾過，濾液回收乙醇，與上述醇提液合并”，60℃減壓濃縮至生藥質(zhì)量濃度為0.4 g/mL和0.6 g/mL，濾過，分別將pH值調(diào)至5，即得。

2.2 定量測定

2.2.1 3種皂苷的測定［6-7］

2.2.1.1 色譜條件Apollo C18-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;體積流量:1.0 mL/min;檢測波長:203 nm，柱溫:30℃。

表1 3種皂苷梯度洗脫條件

2.2.1.2 對照品溶液的制備分別精密稱取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品和三七皂苷R1對照品適量，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg10.309 mg、人參皂苷Rb10.315 mg與三七皂苷R10.130 mg的混合溶液，即得。

2.2.1.3 供試品溶液的制備與測定精密量取洗脫液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。照上述色譜條件，分別精密吸取供試品溶液與對照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積積分值，計算，即得。

2.2.2 川芎嗪的測定

2.2.2.1 色譜條件Apollo C18-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-水(50∶50)為流動相;檢測波長:280 nm;體積流量:1.0 mL/min;柱溫:30℃。

2.2.2.2 對照品溶液的制備精密稱取川芎嗪對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.020 5 mg川芎嗪的溶液，即得。

2.2.2.3 供試品溶液的制備與測定同2.2.1.1項方法。

2.2.3 阿魏酸的測定

2.2.3.1 色譜條件Apollo C18-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-1%的醋酸(35∶65)為流動相;檢測波長:320 nm;體積流量:1.0 mL/min;柱溫:30℃。

2.2.3.2 對照品溶液的制備精密稱取阿魏酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.030 8 mg阿魏酸的溶液，即得。

2.2.3.3 供試品溶液的制備與測定同2.2.1.1項下方法。

2.2.4 羥基紅花黃色素A的測定

2.2.4.1 色譜條件Apollo C18-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-1%磷酸水溶液(38∶62)為流動相;檢測波長:403 nm;體積流量:1.0 mL/min;柱溫:30℃。

2.2.4.2 對照品溶液的制備精密稱取羥基紅花黃色素A對照品適量，加25%甲醇制成每1 mL含0.065 mg的溶液，即得。

2.2.4.3 供試品溶液的制備與測定同2.2.1.1項下方法。

2.3 不同濃度乙醇梯度洗脫能力的考察

2.3.1 實驗方法取生藥質(zhì)量濃度為0.4 g/mL混合提取液吸附飽和的LSA-30樹脂，取生藥質(zhì)量濃度為0.6 g/mL混合提取液吸附飽和的HPD-100樹脂，先用蒸餾水以2 BV/h的體積流量進(jìn)行洗脫，棄去水洗液，然后再依次用10%、30%、50%、70%、95%乙醇進(jìn)行洗脫，各收集洗脫液100 mL，按上述方法測定各成分的含有量，并計算洗脫量與洗脫率。

2.3.2 實驗結(jié)果與分析

2.3.2.1 不同濃度乙醇對三七皂苷R1洗脫吸附的情況結(jié)果見表2及圖1。

表2 三七皂苷R1在兩種樹脂上的梯度洗脫數(shù)據(jù)(n=2)

圖1 三七皂苷R1在樹脂上梯度洗脫的累積洗脫情況

由表2及圖1可見，在LSA-30樹脂上，30%乙醇對三七皂苷R1的洗脫率最高，達(dá)30%，繼用50%和70%乙醇洗脫，累積洗脫率達(dá)53%以上;在HPD-100樹脂上，10%乙醇與30%乙醇洗脫率分別為20%左右，累積洗脫率約為43%，繼續(xù)用50%、70%、95%乙醇洗脫，三七皂苷R1的累積洗脫率不再增加。兩種樹脂相比，從10%乙醇到95%乙醇洗脫，LSA-30樹脂的累積洗脫率高于HPD-100樹脂。

另外，三七皂苷R1在兩種樹脂上的累積洗脫率均低于60%，而95%乙醇洗脫液中已不能檢出三七皂苷R1，故推測其在水洗脫液中可能有一部分損失。

2.3.2.2 不同濃度乙醇對人參皂苷Rg1洗脫吸附的考察結(jié)果見表3及圖2。

表3 人參皂苷Rg1在兩種樹脂上的梯度洗脫數(shù)據(jù)(n=2)

圖2 人參皂苷Rg1在樹脂上梯度洗脫的累積洗脫情況

由表3及圖2可見，在LSA-30樹脂上，70%乙醇可將吸附的人參皂苷Rg1基本脫附完全;而在HPD-100樹脂上，50%乙醇使人參皂苷Rg1基本脫附完全，表明人參皂苷Rg1在HPD-100樹脂上易于脫吸附。兩種樹脂相比，從10%乙醇到95%乙醇洗脫，LSA-30樹脂的累積洗脫率幾乎100%，明顯高于HPD-100樹脂。

另外，人參皂苷Rg1在HPD-100樹脂上的累積洗脫率約為70%，推測損失的原因與上述三七皂苷R1相似，即可能因其在該樹脂上較易脫吸附，其損失部分亦可能在水洗液中。

2.3.2.3 不同濃度乙醇對人參皂苷Rb1洗脫吸附的情況結(jié)果見表4及圖3。

表4 人參皂苷Rb1在兩種樹脂上的梯度洗脫數(shù)據(jù)(n=2)

圖3 人參皂苷Rb1在樹脂上梯度洗脫的累積洗脫情況

由表4及圖3可見，在LSA-30與HPD-100兩種樹脂上，70%乙醇均可將吸附的人參皂苷Rb1基本洗脫吸附完全。兩種樹脂相比，從10%乙醇到95%乙醇洗脫，LSA-30樹脂的累積洗脫率稍高于HPD-100樹脂，人參皂苷Rb1累積洗脫率均達(dá)80%以上

2.3.2.4 不同濃度乙醇對羥基紅花黃色素A［10］洗脫吸附的考察結(jié)果見表5及圖4。

表5 羥基紅花黃色素A在兩種樹脂上的梯度洗脫數(shù)據(jù)(n=2)

注:LSA-30樹脂的吸附量為6.04mg，HPD-100樹脂的吸附量為3.04mg。

圖4 羥基紅花黃色素A在樹脂上梯度洗脫的累積洗脫情況

由表5及圖4可見，在LSA-30樹脂上，70%乙醇可將吸附的羥基紅花黃色素A基本脫吸附完全;而在HPD-100樹脂上，10%乙醇可洗脫約一半的羥基紅花黃色素A，50%乙醇可使其基本脫附完全，表明羥基紅花黃色素A在HPD-100樹脂上更易脫吸附。兩種樹脂相比，從10%乙醇到95%乙醇洗脫，LSA-30樹脂的累積洗脫率與HPD-100樹脂相近。

2.3.2.5 不同濃度乙醇對川芎嗪洗脫吸附的考察結(jié)果見表6及圖5。

表6 川芎嗪在兩種樹脂上的梯度洗脫數(shù)據(jù)(n=2)

圖5 川芎嗪在樹脂上梯度洗脫的累積洗脫情況

由表6及圖5可見，川芎嗪在LSA-30與HPD-100兩種樹脂上，用不同濃度乙醇梯度洗脫，其脫吸附情況較為相似，30%乙醇可使約一半的川芎嗪洗脫吸附，70%乙醇則可使其基本脫附完全。兩種樹脂相比，從10%乙醇到95%乙醇洗脫，LSA-30樹脂的累積洗脫率稍高于HPD-100樹脂。

2.3.2.6 不同濃度乙醇對阿魏酸洗脫吸附的考察結(jié)果見表7及圖6。

表7 阿魏酸在兩種樹脂上的梯度洗脫數(shù)據(jù)(n=2)

圖6 阿魏酸在樹脂上梯度洗脫的累積洗脫情況

由表7及圖6可見，在LSA-30與HPD-100兩種樹脂上，70%乙醇均可將吸附的阿魏酸基本洗脫吸附完全。兩種樹脂相比，從10%乙醇到95%乙醇洗脫，LSA-30樹脂的累積洗脫率稍高于HPD-100樹脂。

3 討論

3.1 在同一樹脂上，盡管上述6種不同結(jié)構(gòu)類型的有效成分在梯度洗脫過程中洗脫吸附的難易或快慢雖然不完全相同，但均可用70%乙醇將其基本洗脫下來，95%乙醇洗脫液中已幾乎不能檢出各有效成分。

3.2 在不同樹脂上，上述6種不同結(jié)構(gòu)類型的有效成分在梯度洗脫過程中洗脫吸附快慢存在明顯的差異，HPD-100樹脂明顯快于LSA-30樹脂，用50%乙醇即可將上述各成分基本脫附完全(人參皂苷Rb1除外)。但從10%乙醇到95%乙醇各成分的累積洗脫率來看，LSA-30樹脂優(yōu)于HPD-100樹脂，這可能與HPD-100樹脂較易脫吸附以致于水洗除雜質(zhì)過程時有效成分亦部分被洗脫而損失有關(guān)。可見，樹脂不是越易洗脫吸附性能就越好，而是應(yīng)該對洗脫劑具有一定的選擇性，方可有效地與雜質(zhì)分開。與HPD-100相比，LSA-100樹脂對于上述6種有效成分具有較好的脫吸附性能。

3.3 從吸附［2］與脫吸附性能研究結(jié)果進(jìn)行綜合評價，采用LSA-100樹脂純化舒胸片相比HPD-100樹脂較優(yōu)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:636.

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