響應面法優(yōu)化蜆殼花椒果皮多糖提取工藝

楊林，邵文斌，于愛紅，束長宇，朱家君，東建麗(蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050)

蜆殼花椒Zanthoxylum dissitumHemsl.，又名單面針、山枇杷、大葉花椒、麻瘋刺、九牛藤、公麒麟、蚌殼花椒等［1］，屬蕓香科花椒屬攀援藤本植物［2］，在我國主要分布于甘肅、陜西、四川、貴州、廣西、廣東、湖南及湖北等省區(qū)［4］。根、莖及葉均可入藥，有祛風活絡、散瘀止痛、解毒消腫之功效，民間用于治療腰腿、關節(jié)疼痛、跌打損傷等癥［4］。傳統(tǒng)中藥主要以水煎劑入藥，蜆殼花椒中水溶性多糖可能是藥物有效成分之一，而多糖類化合物是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它能激活免疫受體，提高機體的免疫功能，在用于癌癥的輔助治療中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等優(yōu)點［5］。

近年來，對蜆殼花椒的研究報道較少，王麗萍等［6］、馬英姿等［7-12］、王平等［13-14］及王海霞等［15］對蜆殼花椒組織培養(yǎng)及生物學特性進行了一系列研究，并發(fā)現(xiàn)蜆殼花椒資源日趨貧乏［7］。湯俊等［16］、韋瑀龍等［17］從蜆殼花椒干燥莖中分別得到8個化合物和6個生物堿類化合物，馬英姿等［18］從蜆殼花椒中性親脂性成分中分離得到6個化合物并具有多種生物活性，未見蜆殼花椒果皮多糖的相關報道。本實驗應用響應面分析法對蜆殼花椒果皮總多糖提取工藝進行優(yōu)化，為蜆殼花椒果皮多糖的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 藥材蜆殼花椒(采自甘肅省文縣碧峰溝，晾干，粉碎)。

1.1.2 試劑葡萄糖(分析純，天津市百世化工有限公司)，苯酚(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)，濃硫酸(分析純，白銀良友化學試劑有限公司)，石油醚(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)，乙醇(分析純，天津市百世化工有限公司)。

1.1.3 儀器AB-105N電子天平(Mettler Toledo Group)，紫外分光光度計(Varian Australia RTY LTD);SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DZF-6020型真空干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 水提醇沉法提取蜆殼花椒總多糖工藝流程原料粉碎→石油醚回流提取(100 mL/g)→過濾→濾渣→95%乙醇回流提取(100 mL/g)→過濾→烘干濾渣→熱水浸提→離心→上清液→濃縮→sevage法除蛋白→80%乙醇醇析→離心→干燥沉淀→粗多糖。

1.2.2 蜆殼花椒果皮多糖提取率的測定

1.2.2.1 標準溶液的制備精密稱取105℃下干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖對照品0.100 0 g，加蒸餾水溶解，定容于250 mL量瓶中，配成0.4 mg/mL的葡萄糖標準溶液。精密吸取標準溶液1、2、3、4、5 mL分別置于10 mL量瓶中，以蒸餾水定容，得系列對照品溶液。

1.2.2.2 標準曲線的制備精密吸取上述系列對照品溶液1.0 mL，分別置于10 mL比色管中，將比色管置于冰水中，分別向比色管加入1 mL苯酚試劑，再加入濃硫酸4 mL，待各管加完后同時搖勻，沸水加熱10 min，冷卻，定容至刻度，于490 nm測定吸光度值。另精密吸取蒸餾水1.0 mL，同法操作，作為空白對照。以吸光度為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程:y=2.767 6x+0.006 9(r=0.999 4)，線性范圍為0～0.2 mg/mL。

1.2.3 多糖提取率的測定精密稱取脫脂并干燥的蜆殼花椒果皮粉末2.000 0 g熱水浸提，過濾，濾液定容至500 mL量瓶中，得供試品溶液。用苯酚-硫酸法測定多糖含有量，精密吸取1 mL供試品溶液于10 mL比色管中，按標準曲線的制備步驟操作，測得的吸光度值代入標準曲線方程計算其濃度，并得出多糖提取率。

1.2.4 單因素試驗

1.2.4.1 提取溫度對多糖提取率的影響精密稱取脫脂干燥蜆殼花椒果皮2.000 0 g，分別在溫度為60、70、80、90、100℃，液料比為60∶1(mL/g)的條件下提取120 min，提取兩次，過濾，濾液冷卻后，每組實驗重復3次，下同，按多糖提取率的測定方法計算總多糖提取率。

1.2.4.2 液料比對多糖提取率的影響精密稱取脫脂干燥蜆殼花椒果皮2.000 0 g，根據(jù)提取溫度篩選結(jié)果，以最佳提取溫度，液料比分別為20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1的條件下提取120 min，提取兩次，過濾，濾液冷卻后，按多糖提取率的測定方法計算總多糖提取率。

1.2.4.3 提取時間對多糖提取率的影響精密稱取脫脂干燥蜆殼花椒果皮2.000 0 g，根據(jù)提取溫度及液料比篩選結(jié)果，分別以最佳提取溫度及液料比條件下提取60、90、120、150、180 min，提取兩次，過濾，濾液冷卻后，按多糖提取率的測定方法計算總多糖提取率。

1.2.4.4 提取次數(shù)對多糖提取率的影響精確稱取脫脂干燥蜆殼花椒果皮2.000 0 g，根據(jù)提取溫度、液料比及提取時間篩選結(jié)果，以最佳提取溫度、液料比及提取時間條件下分別提取1、2、3、4次，過濾，濾液冷卻后，按多糖提取率的測定方法計算總多糖提取率。

1.2.5 響應面分析法對提取工藝的優(yōu)化綜合單因素試驗結(jié)果，根據(jù)Box-benhken的中心組合設計原理［19-20］，采用響應面法對蜆殼花椒果皮多糖的提取工藝進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溫度對多糖提取率的影響試驗數(shù)據(jù)表明，多糖提取率隨著提取溫度的升高而增加，至溫度在90℃時提取率最高，之后提取率隨著溫度的升高而下降，因此選擇最佳提取溫度為90℃，見圖1。

2.1.2 液料比對多糖提取率的影響試驗數(shù)據(jù)表明，多糖提取率隨著液料比的增大而增加，但在液料比80∶1之后提取率有下降趨勢，因此，選擇液料比為80∶1，見圖2。

2.1.3 提取時間對多糖提取率的影響試驗數(shù)據(jù)表明，多糖提取率隨著提取時間的增長有所增加，在150 min之后趨于平緩?？紤]到時間越長，能耗越大，因此，選擇最佳提取時間為150 min，見圖3。

圖1 提取溫度對提取率的影響

圖2 液料比對提取率的影響

圖3 提取時間對提取率的影響

2.1.4 提取次數(shù)對提取率的影響試驗數(shù)據(jù)表明，提取次數(shù)對提取率的影響比較小，提取兩次后，提取率趨于平緩，考慮到提取次數(shù)越多，能耗也越大，因此，選擇最佳提取次數(shù)為2次，見圖4。

圖4 提取次數(shù)對提取率的影響

由以上試驗結(jié)果表明，蜆殼花椒果皮多糖各單因素最佳提取條件為:提取溫度為90℃，液料比為80∶1，提取時間為150 min，提取2次。

2.2 采用響應面分析法對蜆殼花椒多糖提取工藝的優(yōu)化在單因素試驗結(jié)果基礎上，選擇對提取率影響較為顯著的提取溫度(X1)、液料比(X2)、提取時間(X3)3個因素做響應面分析，以X1=(Z1－90)/5、X2=(Z2－80)/10、X3=(Z3－150)/15為自變量，以多糖提取率(Y)為響應值，進行響應面分析試驗，試驗因素與水平設計見表1，具體試驗方案及試驗結(jié)果見表2。

表1 響應面分析因素與水平

表2 BOX-Benhnken試驗設計及結(jié)果

表2中實驗序號1～12為析因試驗，實驗序號13～17為中心試驗。17個試驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點，零點為區(qū)域的中心點，零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。采用Design-Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到回歸方程:Y=5.00+0.090X1+0.057X2－0.021X3+0.011X1X2－0.032X1X3－0.056X2X3－0.33X21－0.23X22－0.12X23。

回歸方程中X1、X2、X21、X22和X23對蜆殼花椒果皮多糖提取率影響極顯著，X2X3對提取率影響高度顯著，其他不顯著，表明各實驗因素對響應面值的影響不是簡單的線性關系。失擬項反映的是實驗數(shù)據(jù)與模型不相符情況，F(xiàn)檢驗結(jié)果為不顯著，因此模型選擇正確。模型的F檢驗結(jié)果為極顯著，復相關系數(shù)R2=0.993 3，表明該回歸方程模型擬合程度非常好。CV=0.64%，數(shù)據(jù)較低，表明實驗操作可信，以上回歸分析表明可以用此模型來分析和預測蜆殼花椒果皮多糖最佳提取工藝條件。見表3，表4。

根據(jù)回歸方程作響應面圖，如圖5～7。在描述任意兩因素間的關系時，當固定其中一個因素不變，試驗初期隨另一因素的增大多糖提取率提高，但達到一定程度后多糖提取率反而降低，響應面試驗規(guī)律與單因素試驗基本一致。圖5～7所示，溫度和液料比對多糖提取率的影響均顯著，變化幅度較大，提取時間的曲線較平緩，表明其對多糖提取率的影響較小。從等高線圖可以看出，三個因素兩兩交互作用對多糖提取率影響大小，與方差分析結(jié)果一致。

表3 回歸方程的方差分析

表4 模型的可信度分析

2.3 模型的驗證有響應面法分析可知，熱水浸提蜆殼花椒果皮多糖的最佳工藝為:提取溫度為94.28℃，液料比為81.72∶1，提取時間為146.48 min，在此條件下的多糖提取率為4.85%。為了驗證響應面法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進行蜆殼花椒果皮多糖的提取試驗，同時考慮到實際情況，將提取工藝參數(shù)修正為:提取溫度為94℃，液料比為82∶1，提取時間為146 min，提取2次，在此條件下做三組平行試驗，測得平均提取率為4.99%，與理論預測值相比，其誤差約為2.87%，在可接受范圍內(nèi)。

圖5 提取溫度(X1)與液料比(X2)對提取率(Y)的響應面與等值線

圖6 提取溫度(X1)與提取時間(X3)對提取率(Y)的響應面與等值線

圖7 液料比(X2)與提取時間(X3)對提取率(Y)的響應面與等值線

3 結(jié)論

采用水提醇沉法提取蜆殼花椒果皮總多糖，利用實驗設計軟件Design-Expert，通過響應面法對多糖提取工藝進行優(yōu)化研究，使蜆殼花椒多糖的提取率最大化。經(jīng)模型分析并修正后，蜆殼花椒果皮多糖的最佳提取工藝為:提取溫度為94℃，液料比為82∶1，提取時間為146 min，提取2次，得出蜆殼花椒多糖平均提取率高達4.99%。采用響應面法分析提取工藝，不但可優(yōu)化出最佳工藝，而且可以對提取率進行預測，其數(shù)據(jù)處理更加簡便、科學。

［1］南京中醫(yī)藥大學.中華本草(第4冊10-12卷)［M］.上海:上?？茖W技術(shù)出版社，1999:986-987.

［2］南京中醫(yī)藥大學.中藥大辭典(上冊)［M］.2版.上海:上?？茖W技術(shù)出版社，2006:183.

［3］《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編(下冊)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1996:1586.

［4］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志(第43卷第2冊)［M］.北京:科學出版社，2004:26-28.

［5］王建，龔興國，多糖的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)研究進展［J］.中國生化藥物雜志，2001，22(1):52-54.

［6］王麗萍，王平，王曉明，等.蜆殼花椒組培苗的生根試驗［J］.經(jīng)濟林研究，2007，25(1):34-37.

［7］馬英姿，王平，梁文斌.藥用植物蜆殼花椒的生境及生物學特性調(diào)查［J］.經(jīng)濟林研究，2007，25(1):25-29.

［8］馬英姿，王平，王曉明，等.蜆殼花椒組培苗的增殖研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版，2007，33(5):552-555.

［9］馬英姿，王平，王海霞.酸堿脅迫對蜆殼花椒組培苗內(nèi)源激素的影響［J］.中南林業(yè)科技大學學報，2008，28(5):59-63.

［10］馬英姿，王平，王曉明，等.藥用植物蜆殼花椒的離體培養(yǎng)及再生體系的建立［J］.湖南師范大學:自然科學學報，2009，32(1):106-111.

［11］馬英姿，楊波華，王平.藥用植物蜆殼花椒種子休眠及萌發(fā)特性［J］.湖南師范大學:自然科學學報，2009，32(2):98-102.

［12］馬英姿，胡忠紅，楊波華，等.蜆殼花椒營養(yǎng)器官解剖結(jié)構(gòu)及其生物堿分布［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版，2009，35(3):242-244.

［13］王平，王海霞，馬英姿，等.蜆殼花椒葉片不定芽誘導與內(nèi)源激素的變化規(guī)律［J］.中草藥，2008，39(9):1400-1403.

［14］王海霞，王平，王曉明，等.蜆殼花椒愈傷組織誘導的影響因素［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版，2008，34(2):147-149.

［15］王海霞，王平.蜆殼花椒組培苗移栽技術(shù)研究［J］.牡丹江師范學院學報:自然科學版，2010(2):37-38.

［16］湯俊，朱衛(wèi)，屠治本.蜆殼花椒化學成分的研究［J］.中草藥，1995，26(11):563-565.

［17］韋瑀龍，張翠仙，林朝展，等.蜆殼花椒中生物堿成分的研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2009，20(5):471-474.

［18］馬英姿，王平，袁園，等.蜆殼花椒中性親脂性成分的抑菌活性及其化學成分［J］.林業(yè)科學，2010，46(2):162-165.

［19］Box G E P，Hunter W G.Statistics for Experiments:An Introduction to Design，Data Analysis and Model Building［M］.New York:Wiley，1990.

［20］費榮昌.試驗設計與數(shù)據(jù)處理［M］.4版.無錫:江南大學出版社，2001:59-63.