柱前衍生化HPLC法測(cè)定丹紅注射液氨基酸

裴玉，肖雪，付嬋，應(yīng)旭輝，梁瓊麟，王義明，羅國(guó)安1，*

(1.江西中醫(yī)學(xué)院研究生部，江西南昌330004;2.南開大學(xué)藥學(xué)院，天津300071;3.清華大學(xué)分析中心，北京100084)

丹紅注射液是由傳統(tǒng)的活血化瘀中藥丹參、紅花提取的復(fù)方制劑。臨床上丹紅注射液用于冠心病、心絞痛、心肌梗死、瘀血型肺源性心臟病(肺心病)、腦血管疾病、萎縮性胃炎以及高血壓腎病等［1］。氨基酸類化合物作為一類常見的大類成分，在以往的中藥注射液研究中常被忽視，本試驗(yàn)為更準(zhǔn)確地控制丹紅注射液質(zhì)量，對(duì)其所含氨基酸進(jìn)行測(cè)定。本試驗(yàn)采用了OPA-FMOC聯(lián)用柱前衍生HPLC法［2-4］，進(jìn)行了氨基酸定量測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器Agilent 1200液相色譜儀，包括在線真空脫氣機(jī)，二元梯度泵，DAD檢測(cè)器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器(美國(guó)Agilent公司);Agilent ChemStation工作站;XP205型十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司);Millipore Elix 5超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.1.2 試藥醋酸鈉、氫氧化鈉、硼酸、36%醋酸、四氫呋喃、三乙胺(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水為超純水;乙腈、甲醇(色譜純，J.T Baker公司);FOMC、OPA、巰基丙酸及各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品:天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)，純度≥99.0%，均購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3 樣品丹紅注射液(菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司提供，批號(hào)為100412、100413、100414、100415、100416、100417、100418、100419)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

OPA衍生試劑配制精密稱取OPA 40 mg，加入0.4 mol/L硼酸鹽緩沖液(pH 10.4)3.5 mL，乙腈0.5 mL，巰基丙酸63 μL，混勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

FOMC衍生試劑的配制精密稱取9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)25 mg，加入5 mL乙腈溶解，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制精密稱取各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，以1%HCl溶液定容至100 mL。單個(gè)氨基酸在混合標(biāo)準(zhǔn)液中的質(zhì)量濃度如下:天冬氨酸0.107 8 mg/mL，谷氨酸0.895 2 mg/mL，天冬酰胺0.064 0 mg/mL，絲氨酸0.053 6 mg/mL，甘氨酸0.162 8 mg/mL，蘇氨酸0.068 7 mg/mL，胱氨酸0.104 1 mg/mL，丙氨酸0.142 6 mg/mL，精氨酸0.147 9 mg/mL，酪氨酸0.041 7 mg/mL，甲硫氨酸0.040 9 mg/mL，纈氨酸0.533 0 mg/mL，色氨酸0.051 0 mg/mL，苯丙氨酸0.206 0 mg/mL，異亮氨酸0.452 0 mg/mL，亮氨酸0.282 0 mg/mL，脯氨酸0.456 0 mg/mL;臨用前使用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

總氨基酸供試液的配制分別取各注射液1 mL于具塞試管中，加入6 mol/L鹽酸9 mL，氮封后蓋緊瓶蓋，110℃恒溫水解24 h;水解液70℃水浴蒸干，后加入1%鹽酸2 mL，超聲10 min，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

1.2.2 色譜條件本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)摸索建立了一個(gè)切實(shí)可行的測(cè)定氨基酸的方法，已在《鄰苯二甲醛-9-氯甲酸芴甲酯柱前衍生HPLC法測(cè)定血必凈注射液中氨基酸》［5］有所應(yīng)用。具體方法如下:Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相A為0.02 mol/L醋酸鈉溶液(含200 μL/L三乙胺和3.5 mL/L四氫呋喃，2%醋酸溶液調(diào)pH 7.2±0.05)，流動(dòng)相B為0.02 mol/L醋酸鈉溶液-甲醇-乙腈(200∶400∶400)(pH 7.2±0.05);柱溫40℃;檢測(cè)波長(zhǎng)、洗脫梯度及體積流量見表1。進(jìn)樣量:20 μL。

表1 流動(dòng)相梯度順序Tab.1 Gradient elution program

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察采用1.2.2項(xiàng)下色譜條件得到混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖及丹紅注射液水解氨基酸色譜圖，見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品(A)和丹紅注射液樣品(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference solution(A)and Danhong Injection(B)

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn)取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各氨基酸色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，并計(jì)算RSD，各氨基酸的RSD均小于0.41%，結(jié)果表明精密度良好，結(jié)果見表2。

表2 精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of precision test and stability test(n=6)

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取氨基酸混和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別于0、2、4、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣，記錄各氨基酸色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，并計(jì)算其RSD，各氨基酸的RSD均小于2.63%，結(jié)果表明樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好，結(jié)果見表2。

2.2.3 線性范圍本試驗(yàn)考察了從母液到稀釋30倍樣品的一系列質(zhì)量濃度梯度，結(jié)果見表3。從結(jié)果可見，各氨基酸在其質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表3 各氨基酸線性質(zhì)量濃度范圍Tab.3 Linear equations and linear ranges

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn)取某一批丹紅注射液水解液，濾過(guò)，平行操作，配制4個(gè)樣品，進(jìn)樣。結(jié)果各氨基酸的RSD小于4%，重復(fù)性良好。見表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of reproducibility test

2.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)取同一批丹紅注射液，稀釋10倍，水解后濾過(guò)，按樣品制備方法平行制備9份樣品，按照80%，100%，120%的比例加入數(shù)個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品(谷氨酸、脯氨酸等)，按2.2項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表5。

根據(jù)結(jié)果可知，各氨基酸加樣回收率均在95%～105%之間，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度和精確度高，方法可靠。

2.3 結(jié)果丹紅注射液氨基酸定量測(cè)定采用了HPLC柱前衍生化法，先用衍生試劑與氨基酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)，然后再用紫外檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，其色譜圖見圖1。測(cè)定了7批丹紅注射液，結(jié)果見表6，7批丹紅注射液水解氨基酸測(cè)定平均值為1.680 mg/mL?？梢钥吹?丹紅注射液經(jīng)過(guò)水解后，質(zhì)量濃度最大的為谷氨酸，其次為脯氨酸、亮氨酸、纈氨酸等;質(zhì)量濃度較小的組氨酸、精氨酸及蛋氨酸，其質(zhì)量濃度均小于0.002 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到谷氨酸、脯氨酸等氨基酸的質(zhì)量濃度RSD較大，提示丹紅注射液質(zhì)量穩(wěn)定性有待提高。本試驗(yàn)所建立的HPLC分析方法對(duì)氨基酸的檢測(cè)選擇性好、分離度高、重復(fù)性強(qiáng)，可用于丹紅注射液中氨基酸的檢測(cè)及質(zhì)量控制。

表5 主要氨基酸回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of recovery test

表6 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.6 Results of Danhong Injection samples

3 討論

按照國(guó)家中藥注射液安全再評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):“多成分制成的注射劑，所測(cè)成分應(yīng)大于總固體量的80%;而經(jīng)質(zhì)量研究明確結(jié)構(gòu)的成分，應(yīng)當(dāng)在指紋圖譜中得到體現(xiàn)，一般不低于已明確成分的90%”。丹紅注射液中含有多種氨基酸，其量約占總固體的5.9%(測(cè)定丹紅注射液總固體量均值為28.33 mg/mL)，因此測(cè)定其中氨基酸的含有量勢(shì)在必行。當(dāng)前中藥注射液的不良反應(yīng)中以過(guò)敏反應(yīng)［6-10］最為明顯，引起過(guò)敏的異體蛋白可能和其中所含結(jié)合氨基酸［11-12］有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中氨基酸類成分研究可為更好地探究中藥注射液的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)，以期達(dá)到臨床安全用藥的目的。

致謝本試驗(yàn)所需樣本均有菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司提供，對(duì)參與該項(xiàng)工作的該公司質(zhì)檢部王臣臣、管雪梅、郭曉光及生產(chǎn)車間等人員一并感謝。

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