動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥性的研究進(jìn)展＊

董衛(wèi)超，劉 凌，杜向黨

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）是一種能夠產(chǎn)生多種毒素并且具有芽孢形成能力的革蘭氏陽性厭氧桿菌。該菌為條件性致病菌，普遍存在于環(huán)境及哺乳動物和禽類的胃腸道中，在條件適宜的情況下能夠迅速繁殖并產(chǎn)生毒素。根據(jù)該菌所產(chǎn)毒素種類不同 （α、β、ε、ι），可分為 A、B、C、D和 E 5型。其中，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要引起人類的氣性壞疽、胃腸道疾病（食物中毒、抗生素樣腹瀉）、嬰幼兒猝死綜合癥，以及動物腹瀉和禽類的壞死性腸炎等；B、C、D和E型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要引起家畜的腸道疾病，同時C型產(chǎn)氣莢膜梭菌還能引起人類的壞死性腸炎［1－2］。多年以來，該菌一直是危害畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康的重要病原菌之一。

近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥性日漸加重，尤其是臨床強(qiáng)毒株逐漸出現(xiàn)了多重耐藥的典型特點(diǎn)。此種狀況勢必加速了強(qiáng)毒株的進(jìn)化適應(yīng)性及快速擴(kuò)散，引起對食品安全和人類健康的潛在威脅。動物梭菌病目前在我國獸醫(yī)臨床較為常見，而其耐藥性的流行病學(xué)資料及耐藥機(jī)制的研究數(shù)據(jù)還相對缺乏。因此，本文就動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥機(jī)制及耐藥基因擴(kuò)散機(jī)理作以下綜述。

1 動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥機(jī)制

1．1 四環(huán)素類 動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌對四環(huán)素類藥物的耐藥性較為常見，主要的耐藥基因包括tet（K）、tet（L）、tet（M）、tetA（P）和tetB（P）等［1］。其中，tet（M）基因編碼核糖體結(jié)合蛋白，該蛋白可促進(jìn)結(jié)合于細(xì)菌30S亞基的四環(huán)素移位，縮短游離態(tài)四環(huán)素的半衰期，從而降低四環(huán)素的抑制作用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥［3］。tetB（P）編碼蛋白與 TetM－like蛋白高度同源［4］。而tet（K）、tet（L）和tetA（P）編碼蛋白的功能基本相似，均為四環(huán)素外排泵蛋白。

Rood等（1985）報道了豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌對四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類－林可胺類、氯霉素等藥物的耐藥狀況。結(jié)果還進(jìn)一步證實，四環(huán)素耐藥基因位于可接合R－質(zhì)粒上［5］。Gholamiandehkordi等（2009）在禽源產(chǎn)氣莢膜梭菌中檢測到tet（K）和tet（L）基因［6］。Slavic等（2010）對多種動物（牛、豬、雞等）源產(chǎn)氣莢膜梭菌四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類等抗菌藥物耐藥狀況進(jìn)行了描述［7］。目前，已在雞、豬、犬、牛等多種動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測到tetA（P）、tetB（P）、tetB（M）基因［1，4］。

1．2 大環(huán)內(nèi)酯類 動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的主要機(jī)制有作用靶位改變和主動外排。其中，erm基因主要通過23SrRNA甲基化使抗生素不能與其靶位結(jié)合而出現(xiàn)耐藥。該耐藥現(xiàn)象不僅局限于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，同時也涉及林可胺類類和鏈陽霉素類，即對大環(huán)內(nèi)酯類－林可胺類－鏈陽菌素類（macrolide－lincosamide－streptogramin B，MLSB）三類藥物同時耐藥［8］。mef（A）基因通過編碼外排泵介導(dǎo)對四環(huán)素耐藥［9］。

Berryman等（1994、1995）在豬和人源梭菌上檢測到ermBP和erm（Q）基 因［8，10］。此 外，Soge 等（2008）在環(huán)境產(chǎn)氣莢膜梭菌中檢測到erm（B）、erm（Q）和mef（A）基因［9］。提示這些耐藥基因已在動物、環(huán)境和人源產(chǎn)氣莢膜梭菌中廣泛存在。

1．3 林可胺類 產(chǎn)氣莢膜梭菌對林可霉素類藥物耐藥主要由lnu基因家族編碼的林可霉素核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，該酶可導(dǎo)致林可霉素的修飾或滅活。

Martel等（2004）已在比利時肉雞中發(fā)現(xiàn)lnu（A）或lnu（B）基 因［11］。Gholamiandehkordi 等（2009）在禽源產(chǎn)氣莢膜梭菌中檢測到lnu（A）和lnu（B）基因［6］。Lyras等（2009）在禽產(chǎn)氣莢膜梭菌中發(fā)現(xiàn)了lnu（P）基因［12］。

1．4 鏈陽霉素類 鏈陽霉素的作用機(jī)制與大環(huán)內(nèi)酯類和林可胺類抗生素相似。因此，細(xì)菌對該三類藥物耐藥往往呈現(xiàn)一定的關(guān)聯(lián)。Berryman等（1994，1995）在動物和人體內(nèi)檢測到erm（B）和erm（Q）基因的同時也發(fā)現(xiàn)，攜帶erm（B）和erm（Q）基因的產(chǎn)氣莢膜梭菌具有 MLSB耐藥表型［8，10］。

1．5 其他類

1．5．1 氯霉素 動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌對氯霉素的主要耐藥機(jī)制由氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，該酶可導(dǎo)致氯霉素修飾或滅活。Rood等（1985，1989）報道了豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌對氯霉素的耐藥狀況。雜交試驗證實，在這些菌中存在catP和catQ基因［5，13］。

1．5．2 桿菌肽鋅 桿菌肽鋅是在家禽養(yǎng)殖業(yè)廣泛應(yīng)用的一個抗菌促生長劑。最近，我們在桿菌肽鋅耐藥禽A型產(chǎn)氣莢膜梭菌上鑒定了bcrABDR基因。這些基因編碼的BcrA、BcrB、BcrD和BcrR蛋白分別和腸球菌桿菌肽鋅耐藥蛋白存在一定的氨基酸同源性。其中，bcrA和bcrB為必需的外排泵功能基因，可導(dǎo)致桿菌肽鋅耐藥，而bcrR為調(diào)控基因［14］。

1．6．2 利奈唑胺 利奈唑胺是首個獲得批準(zhǔn)的惡唑烷酮類抗菌藥物，對包括耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌 （meticillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、耐青霉素肺炎雙球菌（Penicillin－resistant pneumococci，PR－PnC）及耐萬古霉素腸球菌（Vancomycin－resistant enterococci，VRE）在內(nèi)的大多數(shù)革蘭氏陽性病原菌均具有強(qiáng)大的抗菌活性。但隨著該藥的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株也相繼出現(xiàn)。細(xì)菌對利奈唑胺的耐藥機(jī)制主要包括23SrRNA的單個核苷酸突變、cfr基因介導(dǎo)的對23SrRNA的甲基化以及50S核糖體亞基L4蛋白的氨基酸突變等。Holzel等（2010）在豬糞產(chǎn)氣莢膜梭菌中檢測到rplD基因的單一脫氧核苷酸的突變（C→T），該有義突變可引起相應(yīng)的氨基酸突變（71G→D71），從而導(dǎo)致對利奈唑胺耐藥［2］。

2 動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥基因的擴(kuò)散機(jī)理

2．1 四環(huán)素類 Rood等（1985）發(fā)現(xiàn)，豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌四環(huán)素耐藥基因位于可接合R－質(zhì)粒上。通過對人和動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌中接合型R質(zhì)粒與pCW3接合型質(zhì)粒的同源性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)氣莢膜梭菌中檢測到的接合型R質(zhì)粒均源自pCW3－like質(zhì)粒［5，15］。Lyras等（1996）發(fā)現(xiàn)豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌的接合型質(zhì)粒pCW3攜帶tetA（P）、tetB（P）基因［4］。Park等（2010）發(fā)現(xiàn)tetB（P）基因可在雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌中發(fā)生轉(zhuǎn)移［16］。

2．2 大環(huán)內(nèi)酯類－林可胺類－鏈陽霉素類 Brefort等（1977）在豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)現(xiàn)，ermBP基因位于可誘動的非接合質(zhì)粒上［17］。Berryman等（1995）通過試驗推測 產(chǎn)氣莢膜梭菌 基因可能源于腸球菌或者鏈球菌；同時推測erm（Q）基因可能位于接合性質(zhì)粒上［10］。

Lyras等（2009）證實禽產(chǎn)氣莢膜梭菌lnu（P）基因位于轉(zhuǎn)坐因子tISCpe8上，而該轉(zhuǎn)座因子位于接合型質(zhì)粒pJIR2774上，表明lnu（P）基因可以發(fā)生接合轉(zhuǎn)移［12］。

2．3 其他類

2．3．1 氯霉素 Abraham 等（1987）首次在產(chǎn)氣莢膜梭菌梭菌中檢測到攜帶氯霉素耐藥基因位于轉(zhuǎn)座子——Tn4451（pIP401）和Tn4452（pJIR27）上［18］；接著，Rood等（1989）又證實了豬源產(chǎn)氣莢膜梭菌catP位于接合性質(zhì)粒pIP401上［13］。隨后，Lyras等（1998）的報道發(fā)現(xiàn)，catD基因的擴(kuò)散與Tn4451和Tn4453密切關(guān)聯(lián)［19］。

2．3．2 桿菌肽鋅 最近，我們在鑒定桿菌肽鋅耐藥禽A型產(chǎn)氣莢膜梭菌bcrABDR基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過接合試驗，質(zhì)粒雜交試驗和全基因組測序，證實了該基因位于約26kb的接合型轉(zhuǎn)座子上，該轉(zhuǎn)座子暫命名為Tn4455。該轉(zhuǎn)座子可攜帶桿菌肽鋅耐藥基因發(fā)生一定頻率的接合轉(zhuǎn)移（1．2×10－6～2．8×10－1）［14］。

3 結(jié)語與展望

目前，在動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌中鑒定的耐藥基因主要有：四環(huán)素耐藥基因tet（M）、tetA（P）、tetB（P）、tet（K）和tet（L）；大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm（B）、erm（Q）和mef（A）；林可胺類耐藥基因lnu（A）、lnu（B）和lnu（P）；鏈陽霉素耐藥基因erm（B）和erm（Q）；氯霉素耐藥基因catP、catQ和catD；桿菌肽鋅耐藥基因bcrABDR等。其中erm（B）和erm（Q）基因可引起對大環(huán)內(nèi)酯類－林可胺類－鏈陽霉素類（MLSB）三類藥物的共同耐藥。

四環(huán)素耐藥接合型質(zhì)粒pCW3是動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌接合轉(zhuǎn)移的一個重要模式質(zhì)粒［4－5，20］。其tcp（產(chǎn)氣莢膜梭菌接合轉(zhuǎn)移功能區(qū)，由11個基因組成）區(qū)被鑒定為該質(zhì)粒發(fā)揮接合功能的核心功能區(qū)，在已鑒定的大多數(shù)產(chǎn)氣莢膜梭菌接合型質(zhì)粒中均高度保守。而轉(zhuǎn)座子Tn4451、Tn4452、Tn4453和Tn4455等也在產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥相關(guān)基因轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［14，18－19］。特定情況下，非接合型質(zhì)粒也可在接合型質(zhì)粒的誘動下發(fā)生水平轉(zhuǎn)移［8］。

隨著動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥機(jī)制的研究深入，新的耐藥基因?qū)徊粩喟l(fā)掘，例如近年來在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床革蘭氏陽性病原菌 金黃色葡萄球菌腸球菌等）中已出現(xiàn)的可導(dǎo)致對五類藥物（氯霉素類、林可胺類、惡唑烷酮類、截短側(cè)耳素類和鏈陽霉素A，PhLOPSA）共同耐藥的cfr基因是否在動物源產(chǎn)氣莢膜梭菌中存在目前還不清楚。在產(chǎn)氣莢膜梭菌多數(shù)接合型質(zhì)粒中高度保守的tcp區(qū)是如何發(fā)揮接合功能的，還有待于全面的闡明［20］。隨著全基因組測序技術(shù)和功能基因組學(xué)的快速發(fā)展，新的轉(zhuǎn)座子以及接合型轉(zhuǎn)座子將會不斷發(fā)現(xiàn)，其在產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥基因及毒素基因的水平轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用尚需進(jìn)一步的深入認(rèn)識［14］。

近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，多藥耐藥產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株不斷出現(xiàn)，對動物及人類健康造成了極大威脅。有必要對該菌耐藥的發(fā)生及傳播機(jī)制進(jìn)行深入研究，為臨床合理用藥和新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

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