霍亂弧菌O139膠體金免疫層析快速檢測(cè)法的建立

王玉金，楊書豪，劉 麗，龐向宇，孫晨陽，李珊珊

霍亂（Cholera）是由霍亂弧菌（Vibriocholerae）所引起的烈性腸道傳染病，它和鼠疫、黃熱病一起，被世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定為必須實(shí)施國際衛(wèi)生檢疫的三種傳染病之一，在中國屬法定管理的兩種“甲類”傳染病之一?；魜y是一種重要的急性腸道傳染病，以發(fā)病急、傳播快、波及范圍廣、能引起大流行為特征?；魜y病原菌包括O1群和O139群。人類歷史上已有的七次霍亂大流行，均由O1群霍亂弧菌引起。自1992年起，印度和孟加拉國先后發(fā)生O139霍亂，并造成廣泛傳播，我國也有O139霍亂的爆發(fā)或輸入性病例［1］。盡早快速診斷該病原體，對(duì)于迅速控制傳染源、減少病死率具有重要意義。常規(guī)的分離技術(shù)包括增菌、培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定，需要時(shí)間較長(zhǎng)，不適合口岸現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。采用霍亂弧菌O139群的特異性單克隆抗體開發(fā)的膠體金試紙條，可快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地檢測(cè)霍亂弧菌［2］。本研究應(yīng)用雙抗體夾心法及膠體金免疫層析法制備霍亂弧菌O139群膠體金免疫層析試紙條，簡(jiǎn)便快速，并與常規(guī)培養(yǎng)法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，其特異性和靈敏度均較好。

1 材料與方法

1.1 材料 所有菌株均由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心和中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；抗霍亂弧菌O139群?jiǎn)慰?由本所細(xì)胞室提供，3H2用于標(biāo)記，2G8用于包被；兔抗鼠IgG由本所細(xì)胞室制備，血清雙向瓊脂擴(kuò)散效價(jià)≥1∶64；氯金酸（HAuCl4·4H2O）Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素微孔濾膜（NC）美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 膠體金標(biāo)記物的制備

1.2.1 膠體金溶液的制備 參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行。取0.01%HAuCl4水溶液100 m L，加入10 g/L檸檬酸三鈉水溶液2 m L，加熱煮沸15～30 min，直至顏色變紅，即為膠體金溶液。

1.2.2 膠體金標(biāo)記的最佳p H測(cè)定 取10μg/m L單抗3H21.0 m L，分別加入1.0 m L p H 值為6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2的 膠 體 金溶液中，混勻，室溫下放置5 min；再分別加入10%NaCl溶液0.1 m L，混勻，靜置2 h后觀察結(jié)果，確定金標(biāo)記最佳p H值。

1.2.3 最適標(biāo)記蛋白濃度的測(cè)定 取10支試管，各加入1.0 m L膠體金溶液，將單抗3H2分別稀釋成13μg/m L、12μg/m L、11μg/m L、10μg/m L、9 μg/m L、8μg/m L、7μg/m L、6μg/m L、5μg/m L，各取1.0 m L按順序加入上述膠體金溶液中。對(duì)照管加入1.0 m L稀釋液（不含蛋白質(zhì)），混勻，室溫下放置5 min；再分別加入10%NaCl溶液0.1 m L，混勻，靜置2h后觀察結(jié)果，確定最適標(biāo)記蛋白濃度。

1.2.4 單克隆抗體3H2膠體金標(biāo)記物的制備 參照文獻(xiàn)［4］。取膠體金100 m L，用0.1 mol/L K2CO3調(diào)p H值，在攪拌下快速加入單克隆抗體3H2，繼續(xù)攪拌30 min后，加入BSA至10 g/L；再繼續(xù)攪拌15 min，3 000 r/min離心5 min，棄沉淀；上清液再12 000 r/min離心15 min，小心吸棄上清液，沉淀物以p H7.0濃度為0.01 mol/L PBS－2%BSA 溶液溶解，即為膠體金標(biāo)記溶液，將玻璃纖維浸泡于膠體金標(biāo)記溶液中，待完全浸泡均勻后，取出干燥，即成單克隆抗體3 H2膠體金標(biāo)記物。

1.3 包被膜的制備

1.3.1 包被抗體濃度的確定 純化的單抗2G8和兔抗鼠IgG分別用0.5、1、2、3、4、5 mg/m L的濃度用自動(dòng)點(diǎn)膜機(jī)包被制備成包被膜，與同一批膠體金標(biāo)記物裝配成試紙條，觀察結(jié)果，確定包被抗體的最佳濃度。

1.3.2 單克隆抗體2G8及多抗兔抗鼠IgG的包被

參照文獻(xiàn)［5］。分別將兩種抗體裝入兩支潔凈專用掃描筆中；設(shè)定測(cè)試帶（2G8）和質(zhì)控帶（兔抗鼠IgG）寬度均為0.1 cm，二者間距為1 cm，位于NC膜中部；將程序輸入自動(dòng)點(diǎn)膜機(jī)，進(jìn)入工作狀態(tài)；按啟動(dòng)鍵，開始包被，做標(biāo)記符號(hào)。將包被有抗體的NC膜置p H7.0濃度為0.01 mol/L PBS－1%BSA 封閉液中37℃60 min，干燥，即為包被膜。

1.4 試紙條組裝 取潔凈PVC板，將包被膜用雙面膠固著于PVC板固定位置上；將棉漿板連接在NC膜上端，玻璃纖維連接包被膜下端；膠體金標(biāo)記物附著在玻璃纖維下，與包被膜銜接；色膜覆蓋于棉漿板之上；MARK標(biāo)志膜覆蓋于玻璃纖維之上；均勻、輕微滾動(dòng)式推進(jìn)，加強(qiáng)粘和力；用切割機(jī)將貼好的板切割成所需寬度的條，即為成品試紙條。

1.5 測(cè)試方法 將霍亂弧菌O139群膠體金免疫層析試紙條帶MARK標(biāo)志線一端插入裝有樣品的容器中，樣品通過玻璃纖維的層析作用上行與膠體金標(biāo)記物（Au－3 H2）結(jié)合形成抗原抗體（Au－3 H2－O139）復(fù)合物，再移行至包被膜上抗O139單抗（2G8）帶區(qū)，即和2G8結(jié)合，構(gòu)成（Au－3 H2－O139－2G8）雙抗體夾心復(fù)合物，呈現(xiàn)出目測(cè)可見的紅色條帶，全部試驗(yàn)過程僅需5～10min。測(cè)定結(jié)果判斷：陰性：試紙條測(cè)試帶不顯色僅質(zhì)控帶顯色，出現(xiàn)1條紅線；陽性：試紙條測(cè)試帶和質(zhì)控帶均顯色，出現(xiàn)2條紅線；若試紙條質(zhì)控帶無紅線出現(xiàn)，則測(cè)試無效。1.6 膠體金免疫層析試紙條的特異性檢測(cè) 用試紙條對(duì)霍亂弧菌O139群樣品、霍亂弧菌O1群、霍亂弧菌O22群、霍亂弧菌O155群、大腸桿菌、副溶血弧菌、麥?zhǔn)匣【?、傷寒及各型副傷寒桿菌、糞鏈球菌、河弧菌、耶爾森氏菌、痢疾桿菌、變形桿菌、出血性大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 膠體金免疫層析試紙條的敏感性檢測(cè) 將霍亂弧菌O139群菌懸液系列稀釋到109cfu/m L數(shù)量級(jí)，再以樣品處理液10倍系列稀釋到1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103cfu/m L。分別用膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)，觀察結(jié)果。

1.8 膠體金免疫層析試紙條的穩(wěn)定性 將試紙條置2℃～8℃干燥保存，每月定期抽檢至第13個(gè)月，與新制備的試紙條平行檢測(cè)陽性和陰性，比較兩者的檢測(cè)結(jié)果。

1.9 臨床考核 用霍亂弧菌O139群膠體金免疫層析試紙條，與細(xì)菌培養(yǎng)法對(duì)比檢測(cè)臨床標(biāo)本184例，以考核檢測(cè)試紙條法與細(xì)菌培養(yǎng)法的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 膠體金標(biāo)記的最佳p H測(cè)定 膠體金溶液p H由6.3至6.8，顏色有藍(lán)灰變成暗紅，當(dāng)膠體金溶液為6.9、7.0、7.1、7.2時(shí)，免疫膠體金溶液穩(wěn)定，顏色鮮艷，膠體金標(biāo)記蛋白時(shí)最佳p H為6.9。

2.2 最適標(biāo)記蛋白濃度的測(cè)定 含蛋白質(zhì)量少不能穩(wěn)定的膠體金溶液各管呈現(xiàn)由紅變藍(lán)聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白質(zhì)達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量，試管膠體金溶液則保持紅色不變。由表1得知穩(wěn)定膠體金的最低蛋白量為9μg/m L，再加此量的20%即為穩(wěn)定1 m L膠體金所需蛋白質(zhì)（抗體）的實(shí)際用量。因此，霍亂弧菌O139群最佳標(biāo)記蛋白量為每毫升膠體金中加入11μg標(biāo)記單抗3H2。

表1 免疫膠體金標(biāo)記蛋白用量的測(cè)定Tab.1 Optimization on the amount of antibody in labeling colloidal gold

2.3 膠體金標(biāo)記溶液的最適稀釋度 分別將100 m L膠體金標(biāo)記單抗3H2制備的膠體金標(biāo)記沉淀物用p H7.0，濃度為 0.01 mol/L PBS－2%BSA 溶液溶解稀釋為50 m L（原體積的50%）、40 m L（原體積的40%）、30 m L（原體積的30%）、20 m L（原體積的20%），分別按0.1 m L/cm2的用量分散到玻璃纖維上，干燥后與同一批包被膜裝配成試紙條，測(cè)試結(jié)果如表2，結(jié)果表明，膠體金標(biāo)記溶液采用其濃度為原體積的40%制備成的膠體金標(biāo)記物，即可滿足測(cè)試要求。

2.4 包被抗體濃度的確定 測(cè)試結(jié)果如表3，結(jié)果采用2G82mg/m L、兔抗鼠IgG 4 mg/m L的包被量即可滿足所需靈敏度的要求，增加包被抗體的濃度不提高測(cè)試靈敏度。

表2 不同濃度膠體金標(biāo)記物的檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection results of colloidal gold with different concentrations

表3 不同包被濃度的檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Detection results of different coating concentrations

2.5 膠體金免疫層析試紙條的特異性 用試紙條檢測(cè)霍亂弧菌樣品，結(jié)果為陽性，檢測(cè)霍亂弧菌O1群霍亂弧菌O22群、霍亂弧菌O155群、大腸桿菌、副溶血弧菌、麥?zhǔn)匣【?、傷寒及各型副傷寒桿菌、糞鏈球菌、河弧菌、耶爾森氏菌、痢疾桿菌、變形桿菌、出血性大腸桿菌O157∶H7、金黃色葡萄球菌，全部為陰性。

2.6 膠體金免疫層析試紙條的敏感性 用試紙條檢測(cè)稀釋度1×108、1×107、1×106、1×105cfu/m L霍亂弧菌O139群樣品，在檢測(cè)線與質(zhì)控線處均出現(xiàn)紅色條帶，表明檢測(cè)結(jié)果為陽性；而1×104cfu/m L霍亂弧菌O139群樣品檢測(cè)線處顯色可疑；1×103cfu/m L霍亂弧菌O139群樣品僅在質(zhì)控線處出現(xiàn)明顯的紅色條帶，表明檢測(cè)結(jié)果為陰性。因此，該試紙條靈敏度為1×105cfu/m L。

2.7 膠體金免疫層析試紙條的穩(wěn)定性 將試紙條置2℃～8℃干燥保存，每月定期抽檢至第13個(gè)月，與新制備的試紙條平行檢測(cè)陽性和陰性，均未發(fā)現(xiàn)特異性和敏感性降低。

2.8 臨床考核 用霍亂弧菌O139群膠體金免疫層析試紙條，與細(xì)菌培養(yǎng)法在臨床標(biāo)本的對(duì)比試驗(yàn)中，特異性和靈敏度均達(dá)到100%，具體數(shù)據(jù)見表4。

表4 膠體金試紙條與細(xì)菌培養(yǎng)法對(duì)比Tab.4 Comparison on colloidal gold immunochromatography and bacterial culture

3 討 論

免疫膠體金技術(shù)是20世紀(jì)70年代初期由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。目前金標(biāo)記技術(shù)常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測(cè)方式，如免疫滲濾試驗(yàn)和免疫層析試驗(yàn)等。免疫層析試紙條就是此技術(shù)用于體外快速診斷的一個(gè)重要發(fā)展方向，是在現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型檢測(cè)技術(shù)。近年來該技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在臨床診斷特別是床邊檢測(cè)（POCT）中得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、腫瘤等的檢測(cè)。目前已有些非臨床檢測(cè)的應(yīng)用，如毒素、農(nóng)藥殘留、環(huán)境監(jiān)測(cè)、動(dòng)物源性食品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)［6］等。我們建立的霍亂弧菌O139膠體金免疫層析快速檢測(cè)法具有操作簡(jiǎn)便、快速靈敏、不需儀器設(shè)備、能夠同時(shí)檢測(cè)大量樣品等優(yōu)點(diǎn)。適用于多種食品樣品中霍亂弧菌O139的檢測(cè)，可用于出入境口岸對(duì)可疑污染食品的應(yīng)急現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。進(jìn)一步提高免疫層析試驗(yàn)的敏感性、實(shí)現(xiàn)多元檢測(cè)、實(shí)現(xiàn)定量或半定量檢測(cè)是我們今后努力的方向。

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