陜西省市售雞肉中金黃色葡萄球菌的毒力基因及其藥敏檢測(cè)＊

徐本錦，張偉松，王 新，楊保偉，席美麗，夏效東，孟江洪，李新平

2.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，楊凌 712100

金黃色葡萄球菌是引起細(xì)菌性食物中毒的一種重要病原菌，有些菌株能產(chǎn)生多種外毒素（腸毒素、剝脫毒素、中毒休克毒素－1和殺白細(xì)胞素等），能夠?qū)е率澄镏卸净蚋腥荆?］。近年來，隨著抗生素的廣泛使用及濫用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在動(dòng)物源性食品中的檢測(cè)率不斷提高［2－3］，這已成為公共關(guān)注的社會(huì)問題。

已有報(bào)道［3－4］市售雞肉中攜帶“超耐藥菌”MRSA（methicillin－resistantStaphylococcusaureus），而雞肉在我國(guó)是第二大肉類消費(fèi)品，雞肉食品從加工、運(yùn)輸?shù)戒N售的過程中很容易被金黃色葡萄球菌污染。目前，有關(guān)陜西省市售雞肉中金黃色葡萄球菌的耐藥性、毒素基因和MRSA的資料尚不多。本研究對(duì)陜西省市售雞肉樣本中分離的122株金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)、毒素基因檢測(cè)和MRSA流行分析，為我國(guó)雞肉食品的安全評(píng)估提供理論依據(jù)，并為臨床用藥提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基和主要試劑 LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂，MH瓊脂，購(gòu)自陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；Taq DNA聚合酶、d NTPs、100 bp DNA marker、DL2000 DNA marker、引物，購(gòu)自大連寶生物公司；瓊脂糖（Agarose）購(gòu)自Sigma公司；四環(huán)素、慶大霉素、頭孢西丁、頭孢哌酮、阿米卡星、萬古霉素、苯唑西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、氯霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素，阿莫西林/克拉維酸14種抗生素購(gòu)自sigma公司；氯化鈉購(gòu)自西安化學(xué)試劑廠。

1.2 菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株 從陜西省524份市售雞肉樣本中分離鑒定的金黃色葡萄球菌122株，由本實(shí)驗(yàn)室保存；藥敏試驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213和ATCC25923由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 基因組DNA的提取 用棉簽蘸取經(jīng)純化培養(yǎng)的細(xì)菌于LB瓊脂上進(jìn)行活化，用棉簽將活化培養(yǎng)的細(xì)菌置于裝有500μL蒸餾水的1.5 m L離心管中，混勻。加熱煮沸20min后，13 000rpm離心10 min，取上清液，于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增及引物設(shè)計(jì) 按照Zhang［5］等的報(bào)道執(zhí)行mec A基因的引物合成和擴(kuò)增條件，通過PCR擴(kuò)增鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。按照王琴［6］等的報(bào)道執(zhí)行pvl基因的引物合成和擴(kuò)增條件。按照Peles［7］等的報(bào)道執(zhí)行ses和tsst－1基因的引物合成和擴(kuò)增條件。按照Noguchi等［8］的報(bào)道執(zhí)行剝落毒素基因（eta和etb）的引物合成和擴(kuò)增條件。以上引物均由大連寶生物公司合成，引物序列及片段長(zhǎng)度見表1。

1.5 電泳PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度為1%，利用標(biāo)準(zhǔn)大小的DNA Marker，觀察電泳完成后的凝膠，并記錄PCR擴(kuò)增的結(jié)果。

1.6 藥敏性檢測(cè) 參照CLSI［9］推薦的瓊脂稀釋法執(zhí)行14種抗生素的藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1mec A基因和毒素基因檢測(cè) 本研究對(duì)122株金黃色葡萄球菌進(jìn)行mec A基因和毒素基因檢測(cè)，結(jié)果見圖1。4.92%（6/122）的菌株攜帶有mec A基因。59.84%（73/122）的菌株攜帶有毒素基因，其中攜帶兩種以上毒素基因的檢測(cè)率為23.77%（29/122）。pvl基因的檢出率為25.41%（31/122），腸 毒 素 基 因 的 檢 出 率 為 51.64% （63/122），其中含有傳統(tǒng)腸毒素基因（sea－see）的檢測(cè)率為17.21%（21/122），僅含有新型腸毒素基因（segsej）的檢測(cè)率為34.43%（42/122），腸毒素基因中sej的檢出率最高，達(dá)37.70%（46/122），其次是seh，為13.11%（16/122），sea、seb、sec和sed基因的檢出率 分 別為 6.56% （8/122）、3.28% （4/122）、5.74%（7/122）和1.64%（2/122），所有雞肉分離菌株中均未檢測(cè)到see、seg、sei、ets和tsst－1基因。共檢測(cè)到20種毒素基因型，其中最多基因型為sej（21.31%；26/122），其次是pvl（8.20%；10/122）。

表1 PCR擴(kuò)增引物Tab.1 Oligonucleotide primers used in PCR

圖1 122株金黃色葡萄球菌ets、tsst－1、pvl和ses毒素基因檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR detection of ets，tsst－1，pvl and ses genes from 122 S.aureus isolates

2.2 耐藥性檢測(cè) 對(duì)122株金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見表2。菌株對(duì)紅霉素的耐藥率最高（87.70%），耐藥率較高的依次為甲氧芐啶/磺胺甲惡唑（81.97%）、四環(huán)素（67.21%）、阿米卡星（59.02%）、環(huán) 丙 沙 星 （53.28%）、苯 唑 西 林（52.46%）和阿莫西林/克拉維酸（40.16%），對(duì)氨芐西林、氯霉素、慶大霉素、頭孢西丁和頭孢哌酮的耐藥率分別為32.79%、27.05%、20.49%、13.11%和2.46%，所有菌株均對(duì)萬古霉素敏感。

表2 122株雞肉樣本金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果Tab.2 Antimicrobial resistances among 122 S.aureus strains isolated from retail chicken

又對(duì)所有菌株的多重耐藥狀況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖2。122株金黃色葡萄球菌100.00%存在耐藥，其中3.28% （4/122）的株菌對(duì)1種抗生素耐藥，8.20% （10/122 ）的株 菌 對(duì)2種 抗 生 素 耐 藥，13.11%（16/122）的株菌對(duì)3種抗生素耐藥，22.95% （28/122 ）的 株 菌 對(duì)4種 抗 生 素 耐 藥，14.75% （18/122）的 株 菌 對(duì) 5 種 抗 生 素 耐 藥，6.56%（8/122）的株菌對(duì)6種抗生素耐藥，31.15%（38/122）的株菌對(duì)7種或7種以上抗生素耐藥，共產(chǎn)生72種耐藥譜（未列出），多重耐藥（≥3種抗生素）率達(dá)88.52%（108/122）。

圖2 市售雞肉樣本中122株金黃色葡萄球菌的多重耐藥狀況Fig.2 Multidrug resistance（MDR）observation among 122 S.aureus isolates from retail chicken

3 討 論

目 前，國(guó) 內(nèi) 外 很 多 研 究 人 員［2，10－11］已 經(jīng) 對(duì) 金 黃色葡萄球菌各類毒素基因（腸毒素基因，剝脫毒素基因以及中毒休克癥毒素基因等）的流行與分布進(jìn)行了報(bào)道，但其結(jié)果差異很大。本研究分離菌株攜帶毒素基因 （59.84%）與中國(guó)的報(bào)道［10］（63.00%）基本一致，而與美國(guó)［2］（84.9%）和韓國(guó)［11］（29.6%）的報(bào)道差別較大，說明不同國(guó)家和地區(qū)以及不同來源的食源性金黃色葡萄球菌，其毒素基因的流行情況存在一定的差異，但這些毒素基因攜帶率均較高，因此，應(yīng)加強(qiáng)食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測(cè)，防止食物中毒事件的發(fā)生。

已有研究報(bào)道［1，12］食物中毒分離株攜帶較多的新型腸毒素基因，說明新型腸毒素基因的存在可能與食物中毒有關(guān)。本研究分離菌株也攜帶較多（34.43%）的新型腸毒素基因，表明陜西省雞肉存在一定的安全隱患，因此，應(yīng)加強(qiáng)雞肉食品中新型腸毒素基因的檢測(cè)。研究表明，全球95%的金黃色葡萄球食物中毒事件由經(jīng)典腸毒素引起［13］，本研究分離菌株攜帶經(jīng)典腸毒素基因也較多（17.21%），這進(jìn)一步說明市售雞肉存在一定的安全隱患，提示我們應(yīng)加強(qiáng)雞肉中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，防止其腸毒素進(jìn)入食物鏈。

殺 白 細(xì) 胞 素 （panton－valentine leukocidin，PVL）是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的外毒素，是重要的致病因子，能在兒童和成人患者中造成嚴(yán)重的壞死性肺炎和皮膚損害［14］。本研究分離菌株攜帶pvl基因 （25.41%）與國(guó)內(nèi)王鳳玲等［15］（29.7%）和張靜等［16］（19.30%）報(bào)道的基本一致，而與國(guó)外 Gillet等［14］（4.5%）和 Udo等［17］（9%）報(bào)道的差別較大，提示雞肉食品中pvl毒素基因的流行可能具有地域性，應(yīng)加強(qiáng)雞肉食品中金黃色葡萄球菌pvl基因的檢測(cè)。

近年來，食源性金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)出多重耐藥［2，10］的特點(diǎn)，尤其是食源性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantstaphylococcusanreusMRSA）的出現(xiàn)［17］，使得食源性金黃色葡萄球菌的耐藥性問題成為公共關(guān)注的熱點(diǎn)問題，然而，關(guān)于我國(guó)雞肉源金黃色葡萄球菌耐藥特征的報(bào)道并不多，，本研究結(jié)果顯示，雞肉源金黃色葡萄球菌對(duì)紅霉素的耐藥率最高（87.70%），其次為甲氧芐啶/磺胺甲惡唑（81.97%）和四環(huán)素（67.21%），這一結(jié)果與 Pu等［2］和劉冬香等［18］等報(bào)道的食源性金黃色葡萄球菌的耐藥情況存在一定的差異，如劉冬香等［18］報(bào)道中國(guó)動(dòng)物源性食品中金黃色葡萄球菌耐藥率依次為四環(huán)素（42.5%）、紅霉素 （41.6%）和環(huán)丙沙星（2.7%）。而Pu等［2］報(bào)道美國(guó)零售肉中的金黃色葡萄球菌耐藥率依次為四環(huán)素（67%）、紅霉素（30%）、環(huán)丙沙星（13%）和慶大霉素（3%），說明不同國(guó)家和地區(qū)以及不同來源的食源性金黃色葡萄球菌，其耐藥情況存在一定的差異，因此，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管雞肉生產(chǎn)過程中抗生素的使用，避免耐藥菌株的產(chǎn)生。

自20世紀(jì)60年代耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）被發(fā)現(xiàn)以來，MRSA的出現(xiàn)呈上升趨勢(shì)［19］，本研究共檢測(cè)到6株（4.92%）MRSA 菌株，且所有MRSA菌株不僅對(duì)多種抗生素耐藥，而且還攜帶種類和數(shù)目較多的毒素基因，現(xiàn)已有食源性MRSA感染的報(bào)道［17］，因此，應(yīng)加強(qiáng)雞肉食品中MRSA菌株的檢測(cè)，防止其進(jìn)入到食物鏈中。

［1］Yan X，Wang B，Tao X，et al.Characterization ofStaphylococcusaureusstrains sssociated with food poisoning in Shenzhen，China［J］.Appl Environ Microbiol，2012，78：6637－6642.DOI：10.1128/AEM.01165－12

［2］Pu S，Wang F，Ge B.Characterization of toxin genes and antimicrobial susceptibility ofStaphylococcusaureusisolates from Louisiana retail meats［J］.Foodborne Pathog Dis，2011，8（2）：299－306.DOI：10.1089/fpd.2010.0679

［3］Kitai S，Shimizu A，Kawano J，et al.Characterization of methicillin－resistantStaphylococcusaureusisolated from retail raw chicken meat in Japan［J］.J Vet Med Sci，2005，67（1）：107－110.

［4］Nemati M，Hermans K，Lipinska U，et al.Antimicrobial resistance of old and recentStaphylococcusaureusisolates from poultry：first detection of livestock－associated methicillin－resistant strain ST398［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52（10）：3817－3819.DOI：10.1128/AAC.00613－08

［5］Zhang KY，Sparling J，Chow BL，et al.New quadriplex PCR assay for detection of methicillin and mupirocin resistance and simultaneous discrimination ofStaphylococcusaureus from coagulase－negative staphylococci［J］.J Clin Microbiol，2004，42（11）：4947－4955.DOI：10.1128/JCM.42.11.4947－4955

［6］Wang Q，Yang LM，Luo FJ，et al.Antimicrobial resistance and detection ofmecA，qacA/B and pvl genes inStaphylococcusaureus［J］.Chin J Clin Infect Dis，2009，2（2）：102－105.（in Chinese）

王琴，楊麗美，駱方軍，等.金黃色葡萄球菌耐藥性及mec A、qac A/B和pvl基因檢測(cè) ［J］.中華臨床感染病雜志，2009，2（2）：102－105.

［7］Peles F，Wagner M，Varga L，et al.Characterization ofStaphylococcusaureusstrains isolated from bovine milk in Hungary［J］.Int J Food Microbiol，2007，118（2）：186－193.DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2007.07.010

［8］Noguchi N，Nakaminami H，Nishijima S，et al.Antimicrobial agent of susceptibilities and antiseptic resistance gene distribution among methicillin－resistantStaphylococcusaureusisolates from patients with impetigo and staphylococcal scalded skin syndrome［J］.J Clin Microbiol，2006，44 （6）：2119－2125.DOI：10.1128/JCM.02690－05

［9］Udo EE，Al－Mufti S，John Albert M.The prevalence of antimicrobial resistance and carriage of virulence genes inStaphylococcusaureusisolated from food handlers in Kuwait City restaurants［J］.BMC Res Notes，2009，2：108.DOI：10.1186/1756－0500－2－108

［10］Wang X，Meng J，Zhang J，et al.Characterization ofStaphylococcusaureusisolated from powdered infant formula milk and infant rice cereal in China［J］.Int J Food Microbiol，2012，153（1－2）：142－147.

［11］Rhee CH，Woo GJ.Emergence and characterization of foodborne methicillin－resistantStaphylococcusaureusin Korea［J］.J Food Prot，2010，73（12）：2285－2290.

［12］Omoe K，Ishikawa M，Shimoda Y，et al.Detection of seg，seh，and sei genes inStaphylococcusaureusisolates and deter－mination of the enterotoxin productivities ofS－aureusisolates harboring seg，seh，or sei genes［J］.J Clin Microbiol，2002，40（3）：857－862.DOI：10.1128/JCM.40.3.857－862.2002

［13］Kokan NP，Bergdool MS.Detection of low－enterotoxin－producingStaphylococcusaureusstrains［J］.Appl Environ Microbiol，1987，53（11）：2675－2676.

［14］Gillet Y，Issartel B，Vanhems P，et al.Association betweenStaphylococcusaureusstrains carrying gene for Panton－Valentine leukocidin and highly lethal necrotising pneumonia in young immunocompetent patients［J］.Lancet，2002，359（9308）：753－759.DOI：10.1016/S0140－6736（02）07877－7

［15］Wang FL，Hou ZJ，Zhang JY，et al.Correlation between drugresistant genes and pathogenic genes ofStaphylococcusaureus［J］.Int J Lab Med，2011，32（16）：1820－1821.（in Chinese）

王鳳玲，侯振江，張金艷，等.金黃色葡萄球菌耐藥基因及致病毒素基因的相關(guān)性研究 ［J］.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（16）：1820－1821.

［16］Zhang J，Yu SK，Wang X，et al.Characterization of toxin genes and antimicrobial susceptibility ofStaphylococcusaureusisolated from raw milk and milk of clinical mastitis［J］.Chin J Vet Sci，2012，32（5）：759－764，770.（in Chinese）

張靜，于三科，王新，等.原料乳和臨床乳房炎金黃色葡萄球菌毒力基因檢測(cè)及藥敏分析 ［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32（5）：759－764，770.

［17］Jones TF，Kellum E，Porter SS，et al.An outbreak of community－acquired foodborne illness caused by methicillin－resistantStaphylococcusaureus［J］.Emerg Infect Dis，2002，8（1）：82－84.DOI：10.3201/eid0801.010174

［18］Liu DX，Liu SL，Zhang XL，et al.Drug resistance ofStaphylococcusaureusisolated from animal food in Sichuan［J］.Chin J Vet Med，2009，45（5）：6－8.（in Chinese）

劉冬香，劉書亮，張曉利，等.四川省動(dòng)物性食品源金黃色葡萄球菌的耐藥性分析［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45（5）：6－8.

［19］Chen M，Zhou TY，Chen WZ，et al.Methicillin－resistantStaphylococcusaureusin ICU：An analysis on clinical features and resistance［J］.Chin J Nosocomiol，2004.14（2）：223－225.（in Chinese）

陳敏，周陶友，陳文昭，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的臨床和耐藥性［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2004.14（2）：223－225.