水產(chǎn)品中喹乙醇及其主要代謝物殘留的研究進(jìn)展

郭 霞，丁 義，孫振中，戚雋淵，趙思俊

（1.上海市水產(chǎn)研究所，上海市水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，上海 200433；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

喹乙醇（olaquindox，OLA）又名喹酰胺醇，屬于喹惡啉類化合物，是20世紀(jì)70年代初由德國(guó)拜爾公司研究合成的抗菌促生長(zhǎng)劑。喹乙醇對(duì)魚類致病菌如革蘭氏陰性菌、衣原體、螺旋體及放線菌等均有較好的抑制和殺滅作用，可治療淡水養(yǎng)殖魚類出血性敗血癥等疾病[1-2]。另外，喹乙醇能影響代謝，促進(jìn)氮代謝趨于正平衡，提高飼料轉(zhuǎn)化率和利用率，因此國(guó)內(nèi)外廣泛用作水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物飼料添加劑[3]。但喹乙醇添加過(guò)量會(huì)引起中毒（出現(xiàn)腹水和出血癥，不耐運(yùn)輸以及捕撈時(shí)嚴(yán)重大批死亡），且具對(duì)大多數(shù)動(dòng)物具有致畸、致突變作用，對(duì)人也有潛在的三致性，即致畸性，致突變性，致癌性。因此喹乙醇在美國(guó)和歐盟都被禁止用作飼料添加劑?！吨袊?guó)獸藥典》（2005版）也有明確規(guī)定，喹乙醇被禁止用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖。由于喹乙醇的廣泛使用及較大的危害性，對(duì)其進(jìn)行殘留監(jiān)控十分必要。喹乙醇本身不穩(wěn)定，在動(dòng)物體內(nèi)能夠短時(shí)間內(nèi)代謝成十多種產(chǎn)物，其中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）是主要代謝物，在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，是國(guó)際食品法典委員會(huì)認(rèn)定的殘留標(biāo)識(shí)物，因此通常將喹乙醇代謝物（MQCA）作為殘留分析和監(jiān)控的目標(biāo)物[4]。本文對(duì)喹乙醇的毒性及其與主要代謝物的代謝過(guò)程和殘留分析方法進(jìn)行了簡(jiǎn)述，以期為喹乙醇及其主要代謝物MQCA殘留的檢測(cè)及相關(guān)研究提供參考。

1 喹乙醇的毒性及危害

喹乙醇作為飼料添加劑，使用過(guò)量時(shí)會(huì)造成水產(chǎn)動(dòng)物急性中毒。喹乙醇的急性毒性隨動(dòng)物種屬不同存在較大差異，魚類的敏感性相對(duì)較低。葉繼丹等[5]研究了喹乙醇對(duì)不同動(dòng)物的急性毒性試驗(yàn)，得出鯉魚的腹腔注射LD50為1022.6 mg/kg，銀鯽的肌肉注射LD50為407.4 mg/kg。長(zhǎng)期用喹乙醇飼喂水產(chǎn)動(dòng)物，有累積中毒趨勢(shì)，表現(xiàn)為慢性蓄積性中毒。中毒魚頭部發(fā)黑，有時(shí)會(huì)全身性出血。頭部、腹部、鰓、鰭條等明顯充血，體表粘液少，粗糙不光滑。汪開毓等[6]采用劑量定期遞增法測(cè)得喹乙醇在鯉魚體內(nèi)的蓄積系數(shù)為1.45～1.90，為明顯蓄積。他們?cè)邗庺~亞急性喹乙醇中毒的血液生化指標(biāo)研究中發(fā)現(xiàn)，中毒魚表現(xiàn)為特征性的“應(yīng)激性出血綜合癥”。葉繼丹[7-8]對(duì)鏡鯉進(jìn)行了亞慢性毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)喹乙醇可致鏡鯉體內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)下降，在大于1600 mg/kg劑量時(shí)喹乙醇可以明顯干擾鯉魚的正常生化代謝功能。大量研究均表明，喹乙醇對(duì)動(dòng)物機(jī)體具有中度至明顯的蓄積毒性。已中毒或在體內(nèi)蓄積大量喹乙醇但未表現(xiàn)中毒癥狀的魚如被人食用，則可造成喹乙醇在人體內(nèi)的蓄積，從而危害人體健康。

喹乙醇有一定的誘變性，對(duì)一些魚類有明顯的致畸作用。Ames試驗(yàn)、哺乳動(dòng)物體外誘變細(xì)胞試驗(yàn)、哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘變?cè)囼?yàn)和基因突變?cè)囼?yàn)均證實(shí)了喹乙醇有致基因突變的作用。徐韻等[9]進(jìn)行的斑馬魚胚胎發(fā)育試驗(yàn)結(jié)果表明，96 h EC50為221.20 mg/L，具有明顯的致畸效應(yīng)。喹乙醇對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響集中表現(xiàn)在胚胎發(fā)育后期，除卵凝結(jié)、停止發(fā)育以外，高劑量組還出現(xiàn)心臟部位水腫，魚苗腹部紅腫、側(cè)臥等。此外，喹乙醇對(duì)周圍生態(tài)環(huán)境有潛在的不良反應(yīng)。Wollenberger等[10]用喹乙醇對(duì)甲殼細(xì)水蚤進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)喹乙醇對(duì)水環(huán)境有潛在的不良作用?？梢?，長(zhǎng)期使用喹乙醇后在動(dòng)物體內(nèi)和生態(tài)環(huán)境中造成蓄積殘留，可通過(guò)食物鏈間接的對(duì)人類健康造成威脅。

2 喹乙醇及其主要代謝物的藥代動(dòng)力學(xué)研究

喹乙醇經(jīng)消化道吸收，主要在肝臟代謝，代謝過(guò)程中大約有70%以原形物質(zhì)從腎臟排出，其余部分主要以代謝降解產(chǎn)物的形式經(jīng)腎臟排出。已經(jīng)分離到的代謝產(chǎn)物有十多種，其中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）是主要代謝物，在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，存在時(shí)間也較喹乙醇長(zhǎng)，是國(guó)家食品法典委員會(huì)認(rèn)定的標(biāo)示殘留物。

艾曉輝等[11]以30 mg/kg魚體重的劑量口灌給藥，研究了喹乙醇在鯉體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律。通過(guò)血藥濃度經(jīng)時(shí)曲線過(guò)程分析，發(fā)現(xiàn)其符合一級(jí)吸收一室開放模型。主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)：消除相半衰期T1/2k5.876 h，吸收相半衰期T1/2ka1.466 h，達(dá)峰時(shí)間Tp3.913 h，達(dá)峰濃度Cmax30.25 μg/mL，血藥濃度—時(shí)間曲線下面積AUC 406.92 mg/L·h；通過(guò)對(duì)用藥后組織藥物濃度和單次、多次灌藥后肌肉中喹乙醇的殘留量測(cè)定，獲得了單次灌藥后鯉肌肉、肝臟、腎臟和多次灌藥后鯉肌肉中喹乙醇的代謝規(guī)律：喹乙醇在鯉肌肉中吸收和消除的規(guī)律與在血漿中相似，開始濃度逐漸增加，到6 h達(dá)到峰值，其峰濃度為35.325 μg/g，然后濃度逐漸下降，至48 h肌肉中濃度還有17.475 μg/g。喹乙醇在肝臟中的濃度表現(xiàn)為在1 h以前濃度較高，1 h后逐漸下降，到第8 h下降到0.3358 μg/g后又開始回升，第24 h到2.708 μg/g。喹乙醇在腎臟中的濃度表現(xiàn)為在1 h以前濃度較高，以后沒有很明顯的規(guī)律。通常情況下，達(dá)到高峰藥物濃度后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，組織中藥物濃度越來(lái)越低，由于魚類是變溫動(dòng)物，出現(xiàn)這種情況可能與水溫的變化及魚體中某些臟器對(duì)藥物存在再吸收等因素的影響有關(guān)。

陳永平等[12]以20 mg/kg魚體重的劑量注射給藥，研究了喹乙醇及其主要代謝物在羅非魚體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)特征。其血漿、肌肉、肝臟中的藥物濃度—時(shí)間曲線關(guān)系符合一級(jí)吸收的二室開放動(dòng)力學(xué)模型。喹乙醇在羅非魚體內(nèi)消除較快，在血液、肌肉、肝臟中的消除半衰期（t1/2β）分別為5.22、10.48和7.84 h?？傮w清除率（CLs）分別為0.06、0.02和0.03 mg/（kg·h-1）。喹乙醇代謝物MQCA在羅非魚肌肉和肝臟中藥物水平的變化趨勢(shì)與喹乙醇基本相似，血液中并未檢出。3種組織中喹乙醇的平均峰值水平肝臟中最高，血漿中次之，肌肉中最低，喹乙醇在3種組織中的消除速率均較快。48 h后3種組織中喹乙醇的濃度均降到安全限量（0.05 mg/kg）以下，96 h后基本消除。喹乙醇代謝物在肌肉、肝臟中0.25 h達(dá)到最大濃度值，120 h降到安全限量以下（0.02 mg/kg），較喹乙醇達(dá)到安全濃度需要的時(shí)間長(zhǎng)。因此，對(duì)喹乙醇的殘留監(jiān)測(cè)應(yīng)同時(shí)檢測(cè)其主要代謝物MQCA，這樣才能更準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)喹乙醇?xì)埩簟?/p>

3 喹乙醇及其主要代謝物的殘留檢測(cè)方法

喹乙醇在動(dòng)物體內(nèi)能夠短時(shí)間內(nèi)代謝，降解代謝物能夠抑制脫氧核糖核酸的合成，對(duì)染色體畸變有影響，屬致癌物，其主要代謝產(chǎn)物MQCA是喹乙醇監(jiān)控常用的目標(biāo)殘留物。國(guó)內(nèi)外已有較多關(guān)于喹乙醇及其代謝物MQCA的殘留檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫法容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，只能用于初步篩選，目前采用較多的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法等。

3.1 喹乙醇?xì)埩舻臋z測(cè)方法研究

喹乙醇在熱水中溶解度較大，可以采用熱水進(jìn)行提取，但不可避免的會(huì)提取出大量水溶性蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，所以需要同時(shí)采用去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的凈化方法。曾靜[13]等報(bào)道的液質(zhì)聯(lián)用法中是采用60 ℃水做提取溶劑，乙腈去除蛋白質(zhì)，正己烷凈化后質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)，方法的檢出限為10 μg/kg。乙腈也可以做喹乙醇的提取溶劑。謝小華[14]等在水產(chǎn)品中喹乙醇?xì)埩舻母咝б合嗌V檢測(cè)法中采用乙腈提取，正己烷去脂，紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，方法檢出限為2 μg/kg，檢出限較低。趙粼[15]等采用快速溶劑萃?。咝б合嗌V法來(lái)分析魚肌肉組織中的喹乙醇。方法以甲醇為溶劑，采用ASE快速、高壓萃取魚肌肉組織中的喹乙醇，采用乙醇為流動(dòng)相，方法檢出限為5 μg/kg。喹乙醇見光易分解，在樣品前處理過(guò)程中需要注意避光操作，在較暗的房間進(jìn)行。液相色譜法是目前較常采用的檢測(cè)方法。

3.2 喹乙醇主要代謝物MQCA殘留的檢測(cè)方法研究

近幾年，關(guān)于喹乙醇主要代謝物MQCA檢測(cè)方法的報(bào)道逐漸增多。MQCA殘留在動(dòng)物組織中與肌肉結(jié)合緊密，可以利用酸水解、堿水解和酶解等方法使MQCA與肌肉組織分離，形成游離態(tài)的MQCA，達(dá)到提取的目的。一般堿水解反應(yīng)較為劇烈，反應(yīng)后需要調(diào)節(jié)PH值至酸性。酶解條件比較溫和，但需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。酸水解條件較為溫和，同時(shí)可以減少提取液中的雜質(zhì)成分。

吳玉杰等[16]報(bào)道了動(dòng)物組織中MQCA殘留的高效液相色譜檢測(cè)方法。樣品在酸性環(huán)境中水解，經(jīng)乙酸乙酯、磷酸鹽緩沖液依次提取，Oasis MAX固相萃取柱凈化，紫外檢測(cè)器檢測(cè)。魚肌肉組織在4～16 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，MQCA回收率為81%～90%，檢出限（CCα）為2.6 μg/kg，定量限為（CCβ）為4.4 μg/kg。余海霞[17]等研究了堿水解－高效液相色譜法測(cè)定草魚組織中喹乙醇代謝物殘留檢測(cè)方法。草魚肌肉組織通過(guò)堿水解提取MQCA，鹽酸調(diào)PH值，MAX固相萃取柱凈化，高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。在4～200 μg/kg添加范圍內(nèi)，平均回收率為80.5%～86.5%，方法檢出限為4.0 μg/kg。趙東豪等[18]采用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了水產(chǎn)品中殘留的喹乙醇代謝物。樣品用Protease蛋白酶酶解，然后用乙酸乙酯萃取目標(biāo)物，正離子模式下測(cè)定。在2、4、8三個(gè)添加水平上，回收率在82.5%～87.5%之間，定量限為1 μg/kg。梅光明等[19]建立了水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量檢測(cè)的超高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取、液液萃取凈化，流動(dòng)相定容后串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)。添加濃度1～20 μg/kg內(nèi)，回收率在80%～100%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于10%，方法的檢出限為1 μg/kg。與液相色譜法相比，質(zhì)譜檢測(cè)法靈敏度更高，定量更準(zhǔn)確，定性能力更強(qiáng)。

3.3 喹乙醇及MQCA殘留的檢測(cè)方法研究

通過(guò)喹乙醇在魚體內(nèi)的代謝規(guī)律可以知道，單獨(dú)檢測(cè)喹乙醇原藥不能真實(shí)反應(yīng)喹乙醇的殘留情況，而MQCA同時(shí)也是喹烯酮等其它喹惡啉類藥物的殘留標(biāo)識(shí)物，單獨(dú)檢測(cè)也不能說(shuō)明喹乙醇的殘留情況。因此，需要同時(shí)檢測(cè)喹乙醇及其殘留標(biāo)識(shí)物MQCA才能更準(zhǔn)確的反應(yīng)喹乙醇的殘留情況。

陳永平[20]等報(bào)道了高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中喹乙醇及其代謝物的殘留分析方法。文中采用兩種不同的前處理方法分別處理喹乙醇和MQCA殘留樣品，液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，喹乙醇及MQCA的測(cè)定下限分別為1.0 μg/kg，0.5 μg/kg。梅景良[21]等建立了HPLC法同步檢測(cè)鯉魚、對(duì)蝦中喹乙醇與MQCA殘留的方法。方法采用0.3 moL/L的鹽酸溶液提取鯉魚、對(duì)蝦肌肉組織中的殘留物，C18固相萃取柱凈化，紫外檢測(cè)器雙波長(zhǎng)（320 nm和372 nm）同步檢測(cè)，喹乙醇和MQCA的檢測(cè)限：鯉魚肌肉組織中分別為6 μg/kg和10 μg/kg；對(duì)蝦肌肉組織中分別為4.5 μg/kg和8 μg/kg。同時(shí)檢測(cè)喹乙醇及MQCA方法的建立，為喹乙醇及其主要代謝物MQCA的全面監(jiān)控提供了有力的方法保證。

5 小結(jié)

鑒于喹乙醇的毒性和存在的潛在危害，人們重新對(duì)喹乙醇的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)喹乙醇的使用也做出了新的規(guī)定。美國(guó)沒有批準(zhǔn)使用；歐盟也從1999年開起始全面禁止使用喹乙醇；我國(guó)農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局印發(fā)的《2002年底全國(guó)飼料添加劑質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)實(shí)施細(xì)則》也把魚飼料中的喹乙醇作為違禁藥物進(jìn)行監(jiān)督檢驗(yàn)。雖然我國(guó)已經(jīng)明令禁止在水產(chǎn)飼料中添加喹乙醇，但目前喹乙醇仍然作為抗菌促生長(zhǎng)添加劑被廣泛使用，短期內(nèi)還不能完全杜絕。隨著對(duì)喹乙醇及其代謝物研究的深入，高靈敏度檢測(cè)方法的逐步建立和完善，必定會(huì)加強(qiáng)對(duì)喹乙醇及其代謝物的監(jiān)控，保障水產(chǎn)品安全，提高水產(chǎn)品品質(zhì)。

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