松蘿酸提取工藝的研究

錢 驊，趙伯濤，王笑咪

(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京210042)

松蘿(Usnea diffracta Vain.)子囊地衣綱、茶漬目、松蘿科植物，屬藻類和菌類共生結(jié)合成的大型地衣絲狀體，其生長(zhǎng)懸垂附著于松杉或其他樹木的枝干上［1］。目前松蘿主要作為藥用和抗菌素的原料，其有效成分主要有松蘿酸。松蘿酸異名地衣酸，易溶于氯仿、丙酮、乙醇等溶劑中，難溶于水。松蘿酸的鈉鹽為淡黃色絲針晶，溶于水［2］。

目前發(fā)現(xiàn)松蘿酸只存在于地衣中，松蘿酸具有抑菌，消炎，止痛活性，松蘿酸鈉外涂對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠皮膚損傷有加速修復(fù)作用，故可用于治療外傷、潰瘍，燒傷等方面，甚至在某些方面，松蘿酸鈉的生理活性比松蘿酸強(qiáng)［3］;松蘿酸的左、右旋體的抗菌作用無(wú)大的差別，在食品中可作防腐劑應(yīng)用;松蘿酸還具有植物生長(zhǎng)抑制劑活性，可使植物子葉組織中葉綠素及類胡蘿卜素的含量下降，這種性質(zhì)或許將來(lái)可為除草劑利用［4］。

目前松蘿酸的制備主要有有機(jī)溶劑回流提取、滲漉法、超聲波或微波提取后，再經(jīng)過(guò)重結(jié)晶或硅膠柱層析純化的方式，獲得高純度的松蘿酸，再堿化得到松蘿酸鈉。

本實(shí)驗(yàn)利用松蘿酸在堿性溶液中有較大溶解性的特點(diǎn)，探索用堿液或含堿乙醇提取松蘿酸，比較了不同堿性物質(zhì)和堿液濃度、乙醇濃度的影響，利用高效液相層析測(cè)定松蘿酸的含量，以松蘿酸得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行堿水提取工藝優(yōu)化選擇，確定最佳提取工藝，結(jié)果整理如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

破莖松蘿(Usnea diffracta Vain.)由吉林省撫松縣藥材公司提供。松蘿酸對(duì)照品(HPLC測(cè)得含量為96.7875%)氫氧化鈉、碳酸鈉、乙醇、氯仿、苯、醋酸、石油醚、甲醇、正丁醇、乙酸、甲苯等均為分析純。

TU－1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，高效液相色譜儀(安捷倫公司)。

1.2 方法

1.2.1 松蘿酸的提取工藝

松蘿粉碎——堿水/或堿醇——熱回流(90℃，3 h)提取——趁熱過(guò)濾——濾液——加1 mol/L鹽酸酸化(調(diào)pH 2～3)——冰箱(4℃)靜置過(guò)夜——沉淀析出——乙醇加熱(70℃)溶解沉淀——再重結(jié)晶，得到松蘿酸制品。

1.2.2 薄層層析

由文獻(xiàn)配制6種展層劑:(1)氯仿∶苯∶冰醋酸(7∶2∶1)，(2)石油醚∶氯仿∶甲醇(2∶4∶1)，(3)正丁醇∶乙酸:水(4∶1∶1)，(4)氯仿∶苯∶甲醇(4∶4∶1)，(5)甲苯∶乙酸(200∶30)，(6)甲苯∶乙酸(200∶15)。將試樣和松蘿酸標(biāo)樣點(diǎn)于同一薄板、層析、比較。

1.2.3 結(jié)晶體熔點(diǎn)的測(cè)定

結(jié)晶體熔點(diǎn)的測(cè)定采用雙浴式熔點(diǎn)測(cè)定裝置。加熱過(guò)程中，觀察溫度的上升和毛細(xì)管中樣品的情況、記錄始熔(樣品開始塌落并有液相產(chǎn)生)和全熔(固體完全消失時(shí))的溫度。并觀察在初熔前是否有萎縮或軟化，放出氣體以及其它分解現(xiàn)象。

1.2.4 紫外光譜測(cè)定

分別取松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品、各樣品溶液中結(jié)晶體適量，以一定量乙醇溶解后稀釋成一定濃度，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)晶體的紫外光譜，并確定松蘿酸乙醇溶液最大吸收波長(zhǎng)。

通過(guò)紫外光譜檢測(cè)得知，實(shí)驗(yàn)所得的黃色針狀結(jié)晶體(松蘿酸制品)有兩個(gè)吸收峰在210、290 nm左右(圖1)，與松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品(圖2)有相似的紫外吸收峰，且與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

圖1 松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜檢測(cè)

圖2 黃色針狀結(jié)晶體紫外光譜檢測(cè)

1.2.5 HPLC測(cè)定松蘿酸的含量

(1)提取:準(zhǔn)確稱取(5±0.1)g松蘿干粉置于索氏提取器中，95%乙醇索氏提取6 h，至樣液無(wú)色，減壓回收溶劑，真空干燥得松蘿酸粗品。

(2)精密稱取干燥的松蘿酸對(duì)照品(或樣品)，用少量CHCl3溶解，并定容至100 mL容量瓶中。從中吸取1 mL稀釋至10 mL，并用0.45 μm微膜濾器過(guò)濾，備用。

(3)測(cè)定:色譜條件采用Agilent ZORBAX－C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈∶2.5%醋酸溶液(78∶22，pH 3.5);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):285 nm，在此色譜條件下，松蘿酸峰的保留時(shí)間為6.2 min。

圖3 松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)樣品HPLC圖譜

圖4 松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線:以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得回歸方程為，y=57.405x－96.838，相關(guān)系數(shù) R2=0.9991，式中 x為松蘿酸的濃度(μg/mL)，y為峰面積(mAU)。

2 結(jié)果與分析

2.1 破莖松蘿中松蘿酸含量

由1.2.5方法測(cè)定破莖松蘿中松蘿酸含量，結(jié)果見(jiàn)表1，破莖松蘿中松蘿酸含量為2.40%。

表1 破莖松蘿中松蘿酸含量的測(cè)定

2.2 松蘿酸提取

2.2.1 堿水提取

稱取粉碎的松蘿原料50 g，按表2進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，料液比1∶10和1∶8，90℃熱水浴提取提取兩次每次2 h，，濾液合并、酸化，由 1.2.1 得松蘿酸產(chǎn)品。測(cè)定松蘿酸的含量，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 NaOH濃度對(duì)松蘿酸提取的影響

隨著NaOH濃度遞增，松蘿酸產(chǎn)品得率有增加，當(dāng)NaOH達(dá)到1.0%時(shí)，得率最大，為7.2%;松蘿酸含量也是隨著 NaOH濃度的增高而增大的，當(dāng)NaOH濃度為1.5%時(shí)，含量最高，為 27.8，同時(shí)它的轉(zhuǎn)化率［(即產(chǎn)品得率×松蘿酸含量)/材料中松蘿酸中的質(zhì)量］也是最高的，為72.9%，故以堿水提取時(shí)，宜選擇1.5%NaOH作為提取溶劑。

2.2.2 堿醇提取

如2.2.1 稱取、料∶液比，回流提取，酸化，處理，結(jié)果見(jiàn)如表2。

表2 堿醇提取松蘿酸條件

圖7 Na2CO3濃度對(duì)松蘿酸提取影響

圖7是在相同的乙醇濃度(75%)下，不同濃度的Na2CO3濃度對(duì)松蘿酸提取的影響，可看出，隨著Na2CO3濃度的遞增，松蘿酸產(chǎn)品得率增加;產(chǎn)品中松蘿酸含量最高的是1號(hào)處理，且含量隨Na2CO3增加有下降趨勢(shì);而轉(zhuǎn)化率高的是4號(hào)和3號(hào)，分別是86.2%和82.9%。綜合考慮，宜選擇3號(hào)處理，即75%乙醇+4%Na2CO3。

2.3 松蘿酸的檢測(cè)

2.3.1 定性測(cè)定

分別對(duì)松蘿酸標(biāo)樣、1.5%NaOH 和 4%Na2CO3，75%乙醇提取，酸化所制得的松蘿酸產(chǎn)品進(jìn)行性能測(cè)定，如果如表3。比較1.2.2中6種展層劑，結(jié)果表明，以(6)甲苯:乙酸(200∶15)為展開劑時(shí)能使樣品中的松蘿酸得到很好地分離，且展開后黃色斑點(diǎn)清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象，故本實(shí)驗(yàn)以甲苯:乙酸(200∶15)為展層劑。

表3 松蘿酸產(chǎn)品性能

由表3可知，松蘿酸標(biāo)產(chǎn)品(1)和(2)的Rf值與標(biāo)樣相同，熔程接近標(biāo)樣，且產(chǎn)品(1)熔程較產(chǎn)品(2)為短。

2.3.2 HPLC 法測(cè)定

分別以 1.5%NaOH液和 75%乙醇 +4%Na2CO3為松蘿酸提取溶劑，按1.2.1 和 1.2.4 提取和測(cè)定，其HPLC圖為分別為圖8和9和表4。

表4 松蘿酸產(chǎn)品性能

圖8 1.5%NaOH提取所得產(chǎn)品HPLC

圖9 75%乙醇+4%Na2CO3提取所得產(chǎn)品HPLC

3 小結(jié)

(1)堿水為溶劑提取松蘿酸，以1.5%NaOH，料液比1∶10和1∶8，90 ℃提取2次(2+2 h)，松蘿酸轉(zhuǎn)化率最高，為72.9%，松蘿酸產(chǎn)品得率為6.3%，產(chǎn)品中松蘿酸含量為27.8%。

(2)含堿乙醇提取松蘿酸，以75%乙醇+4%Na2CO3提取較好，松蘿酸產(chǎn)品得率和含量分別為8.6%和23.7%，松蘿酸轉(zhuǎn)化率為82.9%。

［1］阿不都拉·阿巴斯，吳繼農(nóng).新疆地衣［M］.烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1998.

［2］Moreno C，Nicola S.A review on usnic acid，an interesting c［J］.Naturwissenschaften，2002;89:137 – 146.

［3］木全章，丁靖凱.地衣化學(xué)成分的研究，抗菌物質(zhì)一松蘿酸［J］.云南植物研究，1975，(2):51 一56.

［3］王 麗，阿地里江·阿不都拉，孫 華.松蘿酸研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2005，16(4):472－473.