側(cè)群細(xì)胞與肺癌腫瘤干細(xì)胞

潘振華 綜述 周清華 審校

Goodell等[1]在研究小鼠骨髓細(xì)胞中造血干細(xì)胞的特性時發(fā)現(xiàn)這樣一群細(xì)胞：當(dāng)以熒光染料Hoechst 33342標(biāo)記時，雙波長二維流式細(xì)胞散點圖上會出現(xiàn)一小群Hoechst 33342低染的細(xì)胞，試驗發(fā)現(xiàn)，與整體骨髓細(xì)胞相比，這群細(xì)胞富集了造血干細(xì)胞活性的細(xì)胞，他們命名這部分細(xì)胞為側(cè)群細(xì)胞，即SP（side population）細(xì)胞。之后，在許多組織器官的干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中都檢測出了含量很少的SP細(xì)胞，這些SP細(xì)胞也都相應(yīng)地具備干細(xì)胞的多種特性，被認(rèn)為是一個濃縮的干細(xì)胞群體[2-6]。2005年，Kim等從支氣管和肺泡導(dǎo)管交界處分離出了支氣管肺泡干細(xì)胞（bronchial alveolar stem cells, BASCs），BASCs表現(xiàn)出明顯的自我更新特性，能夠分化為其它類型的肺上皮細(xì)胞，當(dāng)體內(nèi)支氣管和肺泡損傷時，BASCs能夠分化為終末細(xì)支氣管上皮細(xì)胞（Clara細(xì)胞）、I型肺泡上皮細(xì)胞和II型肺泡上皮細(xì)胞，研究[7]還發(fā)現(xiàn)，K-ras基因突變活化可引起B(yǎng)ASCs增殖，提示BASCs可能是肺腺癌的起源細(xì)胞，這一研究結(jié)果更是激起了人們探尋肺癌腫瘤干細(xì)胞的興趣。2007年，Ho等[8]從包括A549在內(nèi)的6種人肺癌細(xì)胞系和腫瘤組織中分離出了SP細(xì)胞，并試驗驗證了這些SP細(xì)胞具有類干細(xì)胞特性，提出采用SP表型可以分離純化得到肺癌腫瘤起源性細(xì)胞。目前分離腫瘤干細(xì)胞的方法主要包括根據(jù)特異性分子標(biāo)記物分選和根據(jù)SP細(xì)胞表型進(jìn)行分選[9]，而肺癌腫瘤干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記尚未得到確認(rèn)，肺癌SP細(xì)胞的分離和鑒定很有可能為肺癌腫瘤干細(xì)胞的研究提供便利的途徑，本文將就肺癌SP細(xì)胞對于研究肺癌腫瘤干細(xì)胞的意義進(jìn)行階段性綜述。

1 肺癌SP細(xì)胞的干細(xì)胞特性驗證

Patrawala等[3]總結(jié)出干細(xì)胞的本質(zhì)特性包括：①通常所占比例都很低；②盡管具有很強的繁衍潛能，但在正常微環(huán)境中基本不分化；③能實現(xiàn)自我復(fù)制；④具有多向分化的能力；⑤能表達(dá)特殊標(biāo)記物或生物特征以實現(xiàn)識別與富集。近來研究者已先后在A549、H460、H23、H441、H2170、HTB-58、H446和SPC-A1等多種人肺癌細(xì)胞株中分選得到了SP細(xì)胞，它們占總細(xì)胞比例的1.1%-6.3%，并且90%以上都處于G0期-G1期。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，這些肺癌SP細(xì)胞能夠以非對稱方式分化產(chǎn)生SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞，且分化增殖后SP細(xì)胞占總細(xì)胞的比例與分選前原細(xì)胞中SP細(xì)胞比例相近，非SP細(xì)胞則只能增殖而不能分化產(chǎn)生SP細(xì)胞。裸鼠接種試驗[8,10-12]結(jié)果表明，與非SP細(xì)胞和整體細(xì)胞相比，接種SP細(xì)胞的成瘤率提高了幾十倍甚至幾百倍。對從A549細(xì)胞中分選出的SP細(xì)胞進(jìn)行microRNA分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)譜與非SP細(xì)胞有著明顯差異，SP細(xì)胞的microRNA表達(dá)豐度要遠(yuǎn)低于非SP細(xì)胞，這符合干細(xì)胞microRNA的表達(dá)隨著分化的進(jìn)行而逐漸增高的結(jié)論[13]。

2 ABCG2/Bcrp1對研究肺癌SP細(xì)胞和肺癌腫瘤干細(xì)胞的意義

現(xiàn)有研究[2,4,14]已證實，細(xì)胞排出染料Hoechst 33342從而表現(xiàn)出SP表型的能力與ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族有關(guān)，特別是ABCG2/Bcrp1基因與SP表型直接相關(guān)，在Bcrp1-/-小鼠的骨髓細(xì)胞中，SP表型缺失。ABCG2/Bcrp1基因是導(dǎo)致細(xì)胞在傳統(tǒng)化療過程中產(chǎn)生多藥耐藥性的主要轉(zhuǎn)運子之一，與腫瘤干細(xì)胞的強抗藥性特征相符，那么該基因是否可以作為肺癌腫瘤干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物呢？試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Bcrp1-/-小鼠的骨髓細(xì)胞中，雖然SP表型缺失，但是造血干細(xì)胞的數(shù)量與功能仍然維系在正常水平，這一發(fā)現(xiàn)提示，即使Bcrp1能夠作為HSCs的一個標(biāo)記物，但對其干細(xì)胞的功能并無直接影響[14]。Patrawala等[3]通過對30多種腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行反復(fù)試驗驗證，得出如下結(jié)論：雖然腫瘤細(xì)胞中的SP細(xì)胞群較非SP細(xì)胞群成瘤性強，但ABCG2+細(xì)胞和ABCG2-細(xì)胞的成瘤性并無明顯差異。Zhou等[15]報道了關(guān)于小鼠肺組織中的SP細(xì)胞分布和Bcrp1表達(dá)的研究，研究結(jié)果指出，雖然SP細(xì)胞高表達(dá)Bcrp1，但并不是所有表達(dá)Bcrp1的細(xì)胞都具有SP表型。牛等[16]也通過免疫組化方法觀察了ABCG2在肺癌組織及肺癌細(xì)胞系GLC-82和A549中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在大細(xì)胞和小細(xì)胞癌組織中基本未檢出ABCG2，而在肺腺癌和肺鱗癌組織中ABCG2呈彌漫性陽性分布，在兩株細(xì)胞系中ABCG2也幾乎100%陽性表達(dá)，可見ABCG2/Bcrp1雖然與細(xì)胞的SP表型直接相關(guān)，但是單獨并不能作為肺癌腫瘤干細(xì)胞的篩選標(biāo)記。

此外，朱等[17]的另一發(fā)現(xiàn)對于研究ABC轉(zhuǎn)運蛋白與SP表型以及SP表型細(xì)胞的高腫瘤干細(xì)胞特性之間的關(guān)系也很有意義，他們在SPC-A1/Docetaxel細(xì)胞中檢測出了較SPC-A1細(xì)胞更高比例的SP細(xì)胞，但前者中的SP細(xì)胞在增殖能力、克隆形成能力以及致瘤性方面都比后者中的SP細(xì)胞要低，他們分析認(rèn)為，前者細(xì)胞中的高比例SP細(xì)胞主要是由于經(jīng)過了藥物篩選從而高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運蛋白所致，而非全部由天然高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運蛋白的腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生。由此提示，并不是任何情況下得到的SP表型細(xì)胞都能成為腫瘤干細(xì)胞的富集。

3 肺癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀

CD133是細(xì)胞表面蛋白超家族中的一員，已在乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、肝癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等多種實體瘤中被用作腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物[9]。Eramo等[18]從小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中分離得到了一小部分含量極少的CD133+細(xì)胞，通過試驗他們發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞具有自我復(fù)制和多向分化的能力，在無血清培養(yǎng)基中能夠無限增殖，當(dāng)以104數(shù)量級對免疫缺陷小鼠進(jìn)行接種時即能發(fā)展成為同型瘤體，他們認(rèn)為這部分未分化的肺癌CD133+細(xì)胞就是肺癌的腫瘤源性細(xì)胞。而Meng等[19]的研究結(jié)果顯示，肺腺癌細(xì)胞A549和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H446中的CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞中肺癌腫瘤干細(xì)胞含量相似，它們無論在體外克隆、細(xì)胞的自我更新和分化，還是體內(nèi)成瘤和侵襲，以及對化療藥物的耐藥性等各方面的實驗結(jié)果并無明顯差異。錢等[20]的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，CD133+細(xì)胞在人肺腺癌組織、癌旁組織和正常肺組織中廣泛分布，其數(shù)量在三者之間無統(tǒng)計學(xué)差異。

越來越多的研究[9]發(fā)現(xiàn)，以CD133為代表的單個標(biāo)記物應(yīng)用于肺癌腫瘤干細(xì)胞的分離與鑒別具有較大的局限性，而多個表面標(biāo)記物聯(lián)合則有助于提高鑒別的特異性及靈敏度。例如，Kim等[7]發(fā)現(xiàn)肺腺癌可能的起源細(xì)胞BASCs表達(dá)Sca-1+CD45-PECAM-CD34+，Levina等[21]將肺癌細(xì)胞株H460通過阿霉素、順鉑、依托泊苷處理后得到的藥物生存細(xì)胞（drug surviving cells, DSCs）培養(yǎng)后能形成新的克隆，試驗鑒定這些DSCs具有高成瘤高轉(zhuǎn)移等腫瘤干細(xì)胞特性，它們除了高表達(dá)CD133、CD117和OCT-4等干細(xì)胞標(biāo)記物，還高表達(dá)VEGF、bFGF、IL-6、IL-8和受體VEGFR2、FGFR2等。Gutova等[22,23]則應(yīng)用干細(xì)胞標(biāo)記物CD34、CD90、CD133、ABCG2/Bcrp1來分離小細(xì)胞肺癌腫瘤干細(xì)胞。

4 小結(jié)

由上文的綜述可見，關(guān)于肺癌腫瘤干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物到目前為止還沒有得到統(tǒng)一的確認(rèn)，雖然ABCG2/Bcrp1是決定細(xì)胞SP表型的重要基因，但并不是表達(dá)該基因的肺癌細(xì)胞都具有SP表型，它既不能直接影響肺癌SP細(xì)胞的干細(xì)胞活性，也不能單獨作為肺癌腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物。同樣，也并不是所有的肺癌SP細(xì)胞都是肺癌腫瘤干細(xì)胞。Challen等[2]提出，在缺乏確定的細(xì)胞表面標(biāo)志的情況下，SP表型對于某些組織干細(xì)胞而言可能并不是很有效的分離標(biāo)志，并且從不同器官分離的SP細(xì)胞具有異質(zhì)性，只有在明確的證明單個SP細(xì)胞能分化為多個起源于特定組織的細(xì)胞時，組織特異性SP細(xì)胞才能被認(rèn)為是干細(xì)胞。

不過，由于SP細(xì)胞具有廣泛性和表型上的保守性，還是很有可能成為肺癌腫瘤干細(xì)胞研究的理想模型。以肺癌SP細(xì)胞作為研究模型，應(yīng)用微陣列分析等高通量分子生物信息學(xué)手段比較肺癌細(xì)胞中的SP細(xì)胞與正常肺組織干細(xì)胞的SP細(xì)胞基因表達(dá)的差異，對于尋找肺癌腫瘤干細(xì)胞特有的標(biāo)志物有重要意義。依靠特異性標(biāo)志物不僅能有效減少甚至杜絕化療時的嚴(yán)重毒副作用，同時也將為肺癌的早期診斷和預(yù)后奠定基礎(chǔ)。