人肺腺癌Anip973/NVB耐藥細胞系動物模型的建立及其耐藥機制的研究

王萌 洪璇 孫欽文 李瑞林 楊朝陽 陳公琰

肺癌是嚴重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在許多國家均居惡性腫瘤之首。目前，化療仍是晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的主要治療手段，長春瑞濱（Vinorelbine，諾維本，NVB）是治療NSCLC最有效的藥物之一，而多藥耐藥（multidrug resistance, MDR）現(xiàn)象是其化療失敗的重要因素之一。迄今為止，在肺腺癌中關(guān)于NVB誘導的耐藥機制尚未見過報道，本研究的前期研究結(jié)果[1-3]表明，Bcl-2和MRP3在Anip973/NVB細胞系中的表達上調(diào)，且Bcl-2在肝癌、骨肉瘤，小細胞肺癌的耐藥機制中發(fā)揮了重要的作用。MRP家族中與肺癌耐藥有關(guān)的主要是MRP1、MRP3，在NSCLC細胞系中MRP3的表達水平與腫瘤細胞對ADR、VCR、VP-16及DDP等化療藥物的耐藥呈正相關(guān)[4]。

基于以上研究，本研究應用前期建立的Anip973/NVB的耐藥細胞系（已申請專利），建立裸鼠移植瘤模型，通過檢測Bcl-2和MRP3蛋白的表達來進一步研究人肺腺癌Anip973/NVB細胞系的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 NVB（法國皮爾法伯藥物研制公司）；優(yōu)級胎牛血清（中國醫(yī)學科學院生物工程研究所）；RPMI-1640培養(yǎng)液（黑龍江省腫瘤研究所自行配制）；胰酶（黑龍江省腫瘤研究所自行配制）；兔抗人Bcl-2（N-19）多克隆抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司），工作濃度為1:200；兔抗人MRP3單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），工作濃度為1:300；PV-6001（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 細胞株與動物 人肺腺癌細胞株Anip973由哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤研究所惠贈。人肺腺癌耐藥細胞株Anip973/NVB由作者前期誘導建立[5]。

裸鼠（品系nu/nu），雌性，17 g-21 g，4周-6周齡，30只，北京動物研究所繁育，SPF級實驗動物，實驗動物合格證號SCXK（京）2007-0001。所用墊料、飲水、標準飼料及其它與動物接觸的物品均經(jīng)高壓滅菌處理。

1.3 實驗方法 ①皮下移植瘤模型的建立：采用培養(yǎng)細胞皮下接種移植法，用1 mL注射器將人肺腺癌細胞Anip973和耐藥細胞Anip973/NVB以1×107個/只接種1次至裸鼠左腋側(cè)皮下，待瘤體長徑長至約10 mm時開始實驗；②動物：人肺腺癌細胞Anip973成瘤的裸鼠取12只完全隨機化分為Anip973治療組、Anip973對照組；人肺腺癌耐藥細胞Anip973/NVB成瘤的裸鼠取12只完全隨機化分為Anip973/NVB治療組、Anip973/NVB對照組。每組6只，治療組NVB注射劑量按20 mg/kg、0.2 mL生理鹽水稀釋，尾靜脈注射，對照組注射0.2 mL生理鹽水。治療7 d后處死裸鼠，取下皮下腫瘤，稱瘤質(zhì)量。

1.4 觀察指標 ①觀察治療前后瘤體的大?。阂泽w積（mm3）=0.5×長徑（mm）×短徑（mm）2計算腫瘤體積，每天測量1次，繪制生長曲線；②計算抑瘤率（%）=（1-實驗組平均腫瘤重量/對照組平均腫瘤重量）×100%，局部實體瘤生長體積的測定：注射前用游標卡尺測量腫瘤的最長徑（a）和最短徑（b），并稱體重。腫瘤體積（V）=1/6пab2（п表示圓周率）；③形態(tài)學觀察：取1 mm×1 mm×1 mm的新鮮腫瘤組織，用2%戊二醛固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機制片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察；④Bcl-2和MRP3蛋白的表達：方法：標本經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片作免疫組織化學染色（SP法）；一抗分別為：Bcl-2、MRP3；結(jié)果判斷標準：Bcl-2胞漿著色為陽性，MRP3胞漿和（或）胞膜著色為陽性，按陽性細胞占腫瘤的比例，將＜25%為陰性，≥25%且＜50%為陽性，≥50%為強陽性。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SAS 9.1統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，組間比較用析因設(shè)計的方差分析法，兩兩比較結(jié)果用Bonferroni法，兩者相關(guān)性用Pearson相關(guān)系數(shù)（r）分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠生長及成瘤情況 整個實驗過程中裸鼠飲水、進食正常，無腹瀉、活動遲緩等不良反應，無一荷瘤裸鼠自然死亡（圖1）。Anip973細胞移植瘤成瘤率為93.3%（14/15），Anip973/NVB細胞移植瘤成瘤率為86.7%（13/15）。裸鼠在接種后平均6 d成瘤，接種10 d后腫瘤直徑約10 mm。

2.2 移植瘤的生長情況的比較 經(jīng)NVB治療后，Anip973治療組移植瘤生長減緩甚至出現(xiàn)負增長，Anip973對照組、Anip973/NVB治療組、Anip973/NVB對照組移植瘤生長曲線相同（圖2）；Anip973治療組經(jīng)NVB治療的抑瘤率為60.0%，與Anip973對照組比較腫瘤生長明顯受抑（P＜0.001）。Anip973/NVB治療組的抑瘤率為4.65%，腫瘤生長與Anip973/NVB對照組比較無明顯差異（P=0.358）（表1）。

2.3 細胞形態(tài)學觀察 透射電鏡下Anip973細胞移植瘤經(jīng)NVB治療后細胞呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)。細胞體積縮小，微絨毛結(jié)構(gòu)消失，胞膜完整，可見部分細胞核仁消失。部分細胞胞質(zhì)內(nèi)還可見高密度團塊物質(zhì)以及凝聚細胞器的堆積（圖3A）。高倍下細胞胞質(zhì)內(nèi)充滿大量的游離核蛋白體，線粒體少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈小桿狀或囊泡狀，還可見大的胞內(nèi)微腺腔結(jié)構(gòu)，在細胞周圍還可見吞噬細胞的碎片，已形成由質(zhì)膜包裹內(nèi)含完整的細胞器和核碎片等細胞內(nèi)容物的凋亡小體（圖3B）。Anip973/NVB細胞移植瘤經(jīng)NVB治療后細胞形態(tài)不規(guī)則，表面有大量的微絨毛結(jié)構(gòu)，核仁明顯較多，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的細胞器結(jié)構(gòu)（圖3C）。高爾基復合體發(fā)達，線粒體較小，還可見到微腺管結(jié)構(gòu)（圖3D）。

2.4 Bcl-2蛋白和MRP3蛋白的表達 Bcl-2在Anip973/NVB治療組、Anip973/NVB對照組移植瘤中的陽性表達率分別為74%、72%，明顯高于在Anip973治療組、Anip973對照組中的47%、48%（P＜0.001）。MRP3在Anip973/NVB治療組、Anip973/NVB對照組移植瘤中的陽性表達率分別為79%、76%，也明顯高于在Anip973治療組、Anip973對照組移植瘤中的53%、52%（P＜0.001）（表2）。Bcl-2和MRP3的表達無相關(guān)性（r=0.106, P=0.091）（圖4）。

3 討論

腫瘤細胞對抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥是導致腫瘤化學治療失敗的重要原因之一，也是困擾腫瘤治療的關(guān)鍵性難題。NVB作為重要的抗癌藥物，廣泛應用于NSCLC、晚期乳腺癌、霍奇金病、小細胞肺癌等。研究[5]表明，多數(shù)細胞毒制劑通過誘導凋亡來殺傷細胞治療腫瘤。Bcl-2家族是目前最受重視的調(diào)控細胞凋亡的基因家族，肺癌細胞耐藥與凋亡途徑中Bcl-2過度表達相關(guān)[6]。 此外，Bcl-2在許多腫瘤中與化療藥物耐藥密切相關(guān)[7]。在急性髓細胞樣白血病中，Bcl-2與化療藥物耐藥相關(guān)，并且針對Bcl-2 mRNA的反義寡核苷酸增加了AML細胞對表阿霉素的敏感性[8]。在胰腺癌細胞中Bcl-2過表達并通過ERK/Bcl-2通路抵抗化療藥物誘導的凋亡[9]。MRP屬于三磷酸腺苷依賴性跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，其作用機制是通過直接將細胞毒藥物排出和/或?qū)⑺幬锓蛛x成胞內(nèi)的小隔離體，使藥物不能與靶位點結(jié)合，從而導致腫瘤細胞耐藥。有報道在小細胞肺癌中，兩者的聯(lián)合表達與耐藥密切相關(guān)[3]。在肺癌細胞中，MRP3 mRNA表達水平與阿霉素、長春新堿、依托泊苷、順鉑耐藥密切相關(guān)[10,11]。此外， 在胰腺癌細胞中MRP3與氟尿嘧啶耐藥密切相關(guān)；在肝癌細胞中，MRP3與阿霉素耐藥密切相關(guān)[12,13]。

圖1 治療中的裸鼠。箭頭示瘤體。Fig 1 Nude mice in the treatment. Arrow shows the tumor.

圖2 Anip973和Anip973/NVB細胞裸鼠移植瘤生長曲線。NVB治療后，Anip973治療組細胞移植瘤生長緩慢并且抑制了移植瘤的生長（P＜0.001）。然而，Anip973/NVB移植瘤經(jīng)NVB治療后，生長情況與兩個對照組相似（P=0.358）。Fig 2 Tumor growth curves of Anip973 cell and Anip973/NVB cell xenografts. After treated by vinorelbine, Anip973 xenografts grew slowly and vinorelbine inhibited the growth of Anip973 xenografts(P＜0.001). However, growth of Anip973/NVB xenografts treated by vinorelbine was similar with the two untreated groups (P=0.358).

圖3 NVB治療后Anip973和Anip973/NVB細胞透射電鏡圖（×10,000）。A：透射電鏡下Anip973移植瘤細胞經(jīng)NVB治療后細胞呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)。細胞體積縮小，微絨毛結(jié)構(gòu)消失，可見部分細胞核仁消失；B：Anip973移植瘤細胞經(jīng)NVB治療后染色質(zhì)凝聚并形成凋亡小體；C：Anip973/NVB細胞移植瘤經(jīng)NVB治療后，表面有大量的微絨毛結(jié)構(gòu)，核仁明顯較多，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的細胞器結(jié)構(gòu)；D：Anip973/NVB細胞移植瘤經(jīng)NVB治療后高爾基復合體發(fā)達，線粒體較小，還可見到微腺管結(jié)構(gòu)。Fig 3 Morphological changes in apoptosis observed in Anip973 and Anip973/NVB xenografts after treatment with vinorelbine by TEM (×10,000).A: Anip973 cells after treatment with vinorelbine presented apoptotic characteristics, such as cell shrinkage, loss of microvilli and nucleolus ; B:Anip973 cells after treatment with vinorelbine presented chromatin condensation and formation of apoptotic bodies ; C: Anip973/NVB xenografts after treatment with vinorelbine, the surface has a lot of microvilli structure, nucleuos increased clearly, there were rich cytoplasmic in the cytoplasm; D: Anip973/NVB xenografts after treatment with vinorelbine, presented developed golgi complexes, mitochondria was small，and micro-tublar structure can be seen.

表1 各組瘤重及抑瘤率的比較Tab 1 Comparison of tumor weight and inhibition rate among groups

表2 Bcl-2和MRP3蛋白在Anip973和Anip973/NVB細胞裸鼠移植瘤中的表達Tab 2 The expression of Bcl-2 and MRP3 in Anip973 and Anip973/NVB xenografts

圖4 免疫組化法檢測Bcl-2（A，B）和MRP3（C，D）蛋白在Anip973和Anip973/NVB細胞裸鼠移植瘤中的表達（x400）。Bcl-2蛋白的表達在Anip973/NVB治療組（B）高于Anip973治療組（A）。MRP3蛋白的表達在 Anip973/NVB治療組（D）高于 Anip973治療組（C）。Fig 4 The expressions of Bcl-2 (A, B) and MRP3 (C, D) in Anip973 and Anip973/NVB xenografts by immunohistochemistry (x400). The expression of Bcl-2 in Anip973/NVB treatment group (B) was higher than that in the Anip973 treatment group (A)，and the expression of MRP3 in the Anip973/NVB treatment group (D) was higher than that in the Anip973 treatment group (C).

Anip973/NVB細胞系對多種藥物有不同程度的耐藥性，細胞耐藥性狀穩(wěn)定，是可靠的人肺腺癌MDR細胞模型[14,15]。本實驗采用該細胞系建立裸鼠移植瘤模型，成瘤率達到86.7%（13/15）。繪制移植瘤生長曲線發(fā)現(xiàn)，Anip973細胞移植瘤經(jīng)NVB治療后生長明顯減緩甚至縮小，其它三組移植瘤生長無明顯差異，生長曲線接近；稱瘤質(zhì)量，計算出Anip973細胞移植瘤經(jīng)NVB治療的抑瘤率為60%，生長明顯受抑，Anip973/NVB細胞移植瘤的抑瘤率為4.65%，生長沒有受到抑制；電鏡下，經(jīng)NVB治療后Anip973細胞出現(xiàn)凋亡的特征性形態(tài)改變，而Anip973/NVB耐藥細胞未出現(xiàn)細胞凋亡的表現(xiàn)，NVB對其無抑制作用。以上結(jié)果表明Anip973/NVB耐藥細胞移植瘤已對NVB耐藥。文獻[16]報道，MRP與多種腫瘤細胞耐藥密切相關(guān)。亦有研究[10]發(fā)現(xiàn)MRP的過度表達增強了ATP依賴的GS-X泵的轉(zhuǎn)運活性，從而增加GSH-S偶合物對細胞毒藥物的外排，此外MRP還能通過改變胞內(nèi)藥物分布產(chǎn)生耐藥；Bcl-2是凋亡抑制原癌基因，其編碼蛋白具有抑制細胞凋亡作用，并能延長細胞生存期，已證實其在肺癌患者的耐藥性中起著重要的作用[11,12]。本實驗中，免疫組化結(jié)果顯示MRP3及Bcl-2在Anip973/NVB耐藥細胞移植瘤中的陽性表達率明顯高于在Anip973細胞移植瘤中的表達。我們分析可能是由于MRP3通過上述機制致使Anip973/NVB耐藥細胞內(nèi)化療藥物蓄積減少，從而降低了藥物對細胞的毒性作用。我們的研究結(jié)果提示，MRP3基因可能參與了Anip973/NVB耐藥細胞系的多藥耐藥；Bcl-2基因可能通過抑制了長春瑞濱誘導的細胞凋亡，從而延長了Anip973/NVB耐藥細胞的存活期，這可能也是該細胞系產(chǎn)生耐藥的機制之一。此外，經(jīng)一次NVB治療后，MRP3及Bcl-2蛋白在Anip973細胞及Anip973/NVB耐藥細胞移植瘤中的表達與各自對照組比較無明顯差別，提示一次治療可能沒有引起Anip973細胞對NVB耐藥，且Anip973/NVB耐藥細胞經(jīng)NVB治療后沒有對MRP3及Bcl-2蛋白的表達產(chǎn)生影響。本研究未發(fā)現(xiàn)MRP3及Bcl-2蛋白表達在Anip973/NVB耐藥細胞系中的相關(guān)性。

多藥耐藥是一個十分復雜的生物過程，影響因素及參與機制眾多，一種化療藥物耐藥可能涉及多種耐藥基因、蛋白表達的改變。Anip973/NVB細胞系動物模型的建立對今后研究NSCLC對NVB的多藥耐藥機制具有較大的實用價值，我們以后也可以通過此方法檢測其它腫瘤相關(guān)因子來研究該細胞系的多藥耐藥機制。