肺癌循環(huán)腫瘤細胞的研究進展

宋英健 綜述 王正 楊林 審校

根據(jù)世界衛(wèi)生組織最近公布的數(shù)據(jù)，肺癌已成為目前發(fā)病率和死亡率增長最快，對人類健康威脅最大的惡性腫瘤。在我國近幾年來隨著城市空氣污染的加重，特別是PM2.5含量持續(xù)維持高位，肺癌的發(fā)病率和死亡率明顯上升[1]。估計到2025年我國肺癌年死亡人數(shù)可達100萬，將成為肺癌第一大國。隨著個體化治療的不斷深入，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）等基因突變檢測和動態(tài)觀察成為臨床制定治療方案和預(yù)測預(yù)后的重要依據(jù)。2011年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）指南明確指出，對于肺腺癌、大細胞肺癌和組織學(xué)類型不明確的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）等推薦檢測EGFR突變類型。但是由于肺癌早期發(fā)現(xiàn)率低，約70%-80%的患者確診時已為中晚期而無法取得肺癌組織標(biāo)本，也無法接受基因和病理檢測[2]。對于早期病人組織標(biāo)本獲取方法復(fù)雜，而且肺癌基因表型及分子表型可能在治療過程中發(fā)生改變，出現(xiàn)藥物耐藥[3]。目前肺癌組織的分子學(xué)檢測達不到實時、動態(tài)監(jiān)測的目的。為了提高肺癌患者的生存率，降低死亡率，優(yōu)選臨床治療方案，亟需一種手段不僅可以早期預(yù)測肺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，而且可以實時和動態(tài)監(jiān)測肺癌相關(guān)基因的突變類型。

1 循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells, CTCs）概述

1869年Ashworth[4]在1例因癌癥死亡的患者外周血中發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤細胞體積和形態(tài)相似的細胞，從此提出了CTCs的概念。目前CTCs定義為自發(fā)或因診療操作脫離實體瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進入外周血循環(huán)的一類腫瘤細胞，其極少見于正常人[5]。經(jīng)過免疫逃避未被清除的CTCs不僅在一定條件下可以發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶[6]，而且可以通過遷移、粘附、相互聚集形成循環(huán)微癌栓（circulating tumor microemboli, CTM）[7]。最新研究[8]表明這種微小癌栓還可以附著于血管內(nèi)皮，導(dǎo)致血栓形成，引起靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism, VTE）。所以CTCs的檢測與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后評估有密切關(guān)系，而且對于晚期無法取得腫瘤組織的患者起源于實體瘤的CTCs為其靶向治療的分子學(xué)檢測開啟了一扇大門。Maheswaran等[9]利用CTCs檢測EGFR突變類型，其與原發(fā)腫瘤吻合率高達92%，而且CTCs來自于外周血，可以動態(tài)取樣，這充分說明CTCs檢測有可能作為一種基因檢測手段，用于實時動態(tài)檢測腫瘤患者的基因突變類型，指導(dǎo)臨床個體化治療。

2 CTCs檢測方法

2.1 CTCs富集技術(shù) 由于CTCs在外周血存在數(shù)量極少（1個CTC/106-107單個核淋巴細胞）[10]，對于檢測方法靈敏性要求很高，由于生物技術(shù)的局限性，研究者首先嘗試將CTCs進行富集，提高其濃度，從而達到檢測的目的。

密度梯度離心技術(shù)是在單個核淋巴細胞和CTCs的密度與其它血液細胞的密度不同的基礎(chǔ)上，依靠淋巴細胞分離液進行梯度離心富集單個核淋巴細胞和CTCs，從而達到提高CTCs濃度的目的。在此技術(shù)上建立的免疫梯度離心技術(shù)（RosetteSepTM）是建立在陰性選擇的基礎(chǔ)上，利用單抗混合物使非靶細胞與全血中的多個紅細胞交聯(lián)，增加非靶細胞的密度，再通過密度梯度離心，去除非靶細胞，從而增加了CTCs富集的效率[11]。2000年Vona等[12]提出ISET（isolation by size epithelial tumor cells）技術(shù)，主要是利用腫瘤細胞與正常細胞大小不同來分離CTCs。血液通過孔徑8 μm的濾膜過濾，使CTCs聚集于濾膜上，達到富集作用。Oncoquick離心法是在濾膜原理基礎(chǔ)上，利用一個內(nèi)置多孔屏障的專用50 mL試管進行密度梯度離心，避免了全血各個層面的交叉污染，檢出率明顯高于其它方法[13]。此類富集技術(shù)簡單、方便，可以普遍使用。適合富集任何類型腫瘤的CTCs，富集的CTCs可以繼續(xù)后續(xù)免疫學(xué)和基因檢測。但由于需要血液標(biāo)本量大，而且容易出現(xiàn)交叉污染和CTCs的丟失，限制了其進一步應(yīng)用。

免疫學(xué)富集技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的CTCs富集方法。其利用上皮源性的惡性腫瘤均表達上皮粘附因子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）和細胞角蛋白（cytokeratins, CK）等標(biāo)記物的特點，與連有免疫磁性微球（immunomagnetic microsphere, IMMS）的特異性單抗相結(jié)合，于外加磁場的作用下吸附復(fù)合物，達到富集靶細胞的作用[14]。Tewes等[15]利用體外和體內(nèi)試驗對比免疫磁珠技術(shù)與Oncoquick技術(shù)和RosetteSepTM技術(shù)，發(fā)現(xiàn)免疫磁珠技術(shù)回收CTCs的重復(fù)性和敏感性均高于其余兩種技術(shù)。目前通過不同磁珠和外加磁場，利用陰性或陽性選擇方式建立的免疫磁珠富集方法包括MACS系統(tǒng)、Dynabeads系統(tǒng)、EasySep系統(tǒng)等[16-18]。此技術(shù)優(yōu)點為可以保持CTCs完整性，具有較高的重復(fù)性和敏感性。但是由于CTCs的異質(zhì)性，可能導(dǎo)致CTCs遺漏。研究者[14]嘗試聯(lián)合其它的生物標(biāo)記物富集CTCs，結(jié)果表明能明顯提高富集率，而后述的CTCs鑒定技術(shù)也大多采用聯(lián)合多種生物標(biāo)記物檢測的策略。

2.2 CTCs鑒別技術(shù) 隨著生物技術(shù)的進步，越來越多的技術(shù)可以直接標(biāo)記檢測、鑒定CTCs的存在和數(shù)量，根據(jù)檢測原理可分為兩大類，即細胞計數(shù)法和核酸檢測法。

2.2.1 細胞計數(shù)法 流式細胞技術(shù)（flow cytometry, FCM）是目前最常用的細胞檢測技術(shù)。其通過檢測熒光特異性抗體與腫瘤細胞特異性抗原（CK和EpCAM）結(jié)合后產(chǎn)生的熒光信號來鑒別CTCs。由于CK和EpCAM細胞在部分的血細胞中也有表達[19]，所以Kerbs等[20]利用CD45標(biāo)記血細胞，通過陰性選擇將混雜的血細胞排除，達到提高特異性的目的。研究者利用生物標(biāo)記組合，通過不同的光學(xué)檢測設(shè)備設(shè)計了不同的檢測系統(tǒng)，包括FAST系統(tǒng)、LSC系統(tǒng)、ACIS系統(tǒng)和ARIOL系統(tǒng)等。該方法最大的優(yōu)點是定量檢測CTCs的數(shù)量，可以對CTCs多種參數(shù)（大小形態(tài)、細胞類型、存活狀態(tài)、細胞內(nèi)外標(biāo)記物、基因突變檢測）進行分析，但檢測靈敏性較低，需要的血液標(biāo)本較多。

2.2.2 核酸檢測法 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）是目前最常用的核酸檢測方法，由于特異性的mRNA通常不在正常外周血細胞中表達，而且外周血中存在RNA酶，原發(fā)腫瘤組織分泌mRNA進入血液中都被降解。因此我們可以推測外周血中檢測到這些特異性mRNA全部來自于CTCs，間接提示CTCs的存在[21]。而定量RT-PCR（RT-qPCR）技術(shù)和多重RT-qPCR技術(shù)是在原有的基礎(chǔ)上通過增加內(nèi)參基因，利用靶基因的組合提高CTCs檢測的特異性[22]。該方法的優(yōu)點是具有高特異性、定量、快速，而且需要的血液較少。但是值得注意的是由于mRNA易降解、擴增效率和非特異性擴增的影響，會出現(xiàn)假性結(jié)果，該方法也破壞細胞的形態(tài)和功能，中斷了繼續(xù)分析的可能[22-24]。

2.3 富集和鑒定結(jié)合的技術(shù) 隨著對CTCs研究的不斷深入，單個技術(shù)檢測CTCs的敏感性和特異性已不能滿足研究者需求，研究者開始嘗試?yán)酶患夹g(shù)和鑒定技術(shù)相結(jié)合的方法，提高CTCs檢測的敏感性和特異性。

AdnaTest系統(tǒng)[25]通過免疫磁珠技術(shù)將EpCAM標(biāo)記的CTCs進行富集，然后通過RT-PCR檢測腫瘤細胞特異性表達的mRNA，達到檢測CTCs的目的，該方法具有高特異性，便于發(fā)現(xiàn)和鑒別惡性腫瘤的特異性靶標(biāo)。但是方法較為復(fù)雜，而且無法擺脫核酸檢測技術(shù)的缺陷，破壞了細胞結(jié)構(gòu)，無法進行后續(xù)研究。

CellSearch系統(tǒng)是目前唯一通過美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)用于臨床的CTCs檢測技術(shù)，已被應(yīng)用預(yù)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌患者的無進展生存率（progression free survival,PFS）和總生存率（overall survival, OS），其富集方法與AdnaTest系統(tǒng)相似。首先利用免疫磁珠技術(shù)將EpCAM標(biāo)記的CTCs從血液樣本中富集出來，然后通過特殊的生物標(biāo)記或化學(xué)染色（CK8/18/19和DAPI陽性、CD45陰性）準(zhǔn)確識別CTCs[25,26]。Βalic等[27]利用CellSearch技術(shù)和Oncoquick技術(shù)同時檢測61個腫瘤轉(zhuǎn)移患者的CTCs，發(fā)現(xiàn)CellSearch技術(shù)無論敏感性和回收率都高于Oncoquick技術(shù)。CellSearch技術(shù)具有高敏感性和特異性，由于形成了固定的系統(tǒng)，并經(jīng)過FDA認(rèn)證，具有自動化、高效性、高重復(fù)性的特點，而且所需血液樣本量少，易于重復(fù)檢測；缺點為仍存在漏診和誤診的情況，且檢測費用較高，使其在臨床上廣泛應(yīng)用受限，而且通過系統(tǒng)處理的CTCs回收困難，阻礙了CTCs的后續(xù)分析[26,27]。為了進一步提高CTCs檢測效率，Hou等[28]將ISET技術(shù)和CellSearch技術(shù)結(jié)合使用，輔以核染色的方法，不僅準(zhǔn)確檢測出CTCs，還證明了CTM的存在，但仍無法擺脫臨床應(yīng)用的局限性。

2.4 其它檢測方法 2007年馬薩諸塞州總醫(yī)院開發(fā)了第一代CTC芯片（CTC-Chip），其在微流體學(xué)的CTCs檢測技術(shù)基礎(chǔ)上，采用微流芯片的技術(shù)，利用包被抗體的位點叢捕獲流過芯片的CTCs，達到檢測CTCs的目的。Nagrath等[29]利用CTC-Chip技術(shù)，通過EpCAM抗體篩選CTCs，篩選出的細胞再通過CK/DAPI/CD45來驗證，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)具有高敏感性和特異性。但是這種芯片不僅制造相對困難、成本昂貴，且顯微位點周圍的血流通暢性限制了與抗體覆蓋位點接觸的CTCs數(shù)量。而第二代CTC-Chip芯片（microvortex-generating herringbone-chip,HΒ-Chip）通過一種小室流動槽，使樣品快速混合，增加了血液的通過量和效率；并通過安裝標(biāo)準(zhǔn)載玻片，利用標(biāo)準(zhǔn)的病理檢測方法對癌細胞進行鑒別，提高檢測的準(zhǔn)確性，捕獲的CTCs還可用于其它檢測或培養(yǎng)。研究證實HΒ芯片在CTC芯片的基礎(chǔ)上提高了25%的癌細胞捕獲率，可捕捉血液樣本中超過90%的癌細胞，研究中從幾個患者的血液樣本中捕捉出4到12個循環(huán)腫瘤細胞群組成的CTM，其可能成為研究和檢測CTM的新方法。CTCChip技術(shù)通過模擬生物微環(huán)境篩選CTCs，保持CTCs活性，具有高敏感性和特異性，可以繼續(xù)后續(xù)的形態(tài)學(xué)和分子學(xué)的檢測，并且需要的血液標(biāo)本較少，易于重復(fù)測量。由于仍局限于EpCAM篩選CTCs，可能會產(chǎn)生假性結(jié)果[30]。

研究者[31]還利用酶聯(lián)免疫斑點法（enzyme linked immunospot assay, ELISPOT）來檢測乳腺癌和前列腺癌患者血液中CTCs的存在，通過檢測CTCs分泌的相關(guān)蛋白-上皮特異性粘蛋白和前列腺特異性抗原，判斷CTCs存在。此技術(shù)可以驗證CTCs的活性，還能檢測到腫瘤形成過程中細胞表達分泌的重要蛋白，對于CTCs與腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的相關(guān)性研究具有重要意義。但是該方法檢測靈敏度較低，而且目前無法估計CTCs的數(shù)量，應(yīng)用于CTCs檢測的可行性還需要進一步研究證實。

3 肺癌CTCs臨床應(yīng)用

目前普通的血液學(xué)檢測和高分辨率的影像學(xué)檢測仍然無法準(zhǔn)確的診斷和預(yù)測肺癌患者轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后，也無法實時、動態(tài)選擇個體化治療方案，而與轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有密切關(guān)系的CTCs恰恰彌補了這些不足。

3.1 臨床診斷和分期 由于血液系統(tǒng)是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑，CTCs存在逐漸成為診斷惡性腫瘤的潛在標(biāo)準(zhǔn)。研究[32]顯示CTCs對肺癌診斷也具有潛在的應(yīng)用價值。Βevilacqua等[33]利用CellSearch系統(tǒng)在1例肺組織穿刺活檢診斷為低分化神經(jīng)內(nèi)分泌瘤的患者外周血中檢測到EpCAM和CK陽性的CTCs，然而EpCAM通常在低分化神經(jīng)內(nèi)分泌瘤中不表達，最后在肝臟轉(zhuǎn)移灶中確診為EpCAM和CK陽性的小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）。Tanaka等[34]利用CellSearch技術(shù)比較125例肺癌患者和25例肺良性腫瘤患者的CTCs陽性率，其以1個CTC/7.5 mL作為分界點，發(fā)現(xiàn)肺癌患者陽性率（30.6%）明顯高于良性腫瘤患者陽性率（12.0%），說明CTCs對于肺癌診斷具有指導(dǎo)意義，可能成為高?；颊咴缙诤Y查協(xié)助診治的重要手段。與傳統(tǒng)診斷手段相比，CTCs在肺癌的診斷中還處于摸索階段，還需要更多臨床證據(jù)支持，但聯(lián)合CTCs檢查后的綜合診斷會提高臨床醫(yī)師診療的警惕性。

雖然血液中檢測到腫瘤細胞并不意味著一定存在轉(zhuǎn)移灶，但研究[35]認(rèn)為CTCs與腫瘤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，CTCs計數(shù)越多患者面臨遠處轉(zhuǎn)移的負(fù)荷越重，未來發(fā)生轉(zhuǎn)移的病灶數(shù)也越多。Tanaka等[34]利用受試者工作特征曲線 （receiver operating characteristic curve, ROC曲線）證明了肺癌患者外周血中CTCs的含量跟肺癌進展特別是肺癌轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。Hou等[36]的研究同樣表明，CTCs的存在與腫瘤分期存在明顯的相關(guān)性，CTCs計數(shù)隨著疾病分期的增加而明顯增加，廣泛期患者計數(shù)明顯高于局限期；而且發(fā)現(xiàn)SCLC患者外周血中CTCs計數(shù)明顯高于其它類型的肺癌，這也驗證了臨床上SCLC患者更容易發(fā)生全身轉(zhuǎn)移。Yie等[37]應(yīng)用RT-PCR對143例NSCLC患者進行檢測，發(fā)現(xiàn)表達Survivn mRNA的CTCs與腫瘤侵犯程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有關(guān)。目前CTCs可作為肺癌組織學(xué)類型及臨床分期的有益補充，其存在可被視為腫瘤TNM分期的中M分期的真實狀態(tài)。結(jié)合病理學(xué)和影像學(xué)的檢查結(jié)果，可以更準(zhǔn)確的反映患者當(dāng)前病情。

3.2 預(yù)后判斷和療效評價 肺癌患者的預(yù)后和抗腫瘤藥物的療效與多種因素有關(guān)，目前眾多的研究提示CTCs可早期判斷預(yù)后，評價抗腫瘤藥物療效。一項小規(guī)模的臨床研究[38]中利用CellSearch技術(shù)，以2個CTCs/7.5 mL作為分界點，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)肺癌患者比新發(fā)肺癌患者CTCs陽性率高（83% vs 78%），說明了CTCs與肺癌復(fù)發(fā)有密切關(guān)系。而且在其中12例患者的隨訪中同種方案一線化療2個療程后影像學(xué)變化與CTCs變化具有相關(guān)性，影像學(xué)中腫瘤好轉(zhuǎn)伴隨著CTCs計數(shù)的減少。雖然為小樣本的臨床實驗，但是可以看到CTCs在肺癌的預(yù)后評估和療效評價方面的重要性。

在NSCLC領(lǐng)域Hofman等[39,40]認(rèn)為利用ISET技術(shù)從手術(shù)后NSCLC患者外周血中分離出的細胞為非血細胞的循環(huán)細胞（circulating non-haematological cells, CNHCs），通過對比發(fā)現(xiàn)上述患者10 mL外周血中含有50個CNHCs以上患者的OS和PFS明顯低于另一組，并且在I期+II期患者中具有較高的復(fù)發(fā)和死亡的風(fēng)險。而CNHCs中CTCs的存在可能是導(dǎo)致陽性結(jié)果的重要原因。2011年Krebs等[20]利用CellSearch技術(shù)檢測101例III期-IV期NSCLC患者CTCs數(shù)量，未化療前以5個CTCs/7.5 mL為分界點，發(fā)現(xiàn)其OS存在統(tǒng)計學(xué)差異（＞5：4.3個月；＜5：8.1個月）；同種方案化療1周期后以2個CTCs/7.5 mL為分界點，多因素分析發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)量跟化療后療效和OS有關(guān)，說明CTCs檢測在預(yù)測NSCLC患者化療療效和預(yù)后方面具有重要作用。

在SCLC中研究者利用CellSearch技術(shù)發(fā)現(xiàn)在50例患者中80%的患者CTCs陽性，其中在7.5 mL血液中CTCs含量＞300的患者中位生存期（134天）明顯低于CTCs含量＜2的患者中位生存期（443天），而且經(jīng)過1個療程一線化療后大多數(shù)患者出現(xiàn)CTCs含量下降，在22天時陽性率只有60%，說明CTCs可以反映SCLC變化和評估化療方案療效[36]。Hou等[28]在小樣本研究（97例SCLC患者）中發(fā)現(xiàn)未治療前CTCs數(shù)量和化療后CTCs變化量可以預(yù)測患者OS。而且他們認(rèn)為ISET技術(shù)和CellSearch技術(shù)篩選出的CTCs中還存在CTM和已凋亡的CTCs，他們通核染色方式將篩選出的CTCs分為單個有活性CTCs、CTM和凋亡CTCs三組，而在CTM中并未發(fā)現(xiàn)凋亡CTCs，這可能預(yù)示著CTM存在特殊的保護機制防止CTCs凋亡和化療藥物的殺傷，其可能成為肺癌治療的新靶點。

在乳腺癌領(lǐng)域2012年即將公布初步結(jié)果的SWOG S0500試驗中，隨機選取500例（≥5CTCs）乳腺癌轉(zhuǎn)移女性患者，研究其在化療3周后CTCs持續(xù)高表達（≥5CTCs）換用其他化療方案患者是否受益。其研究的主要終點為PFS和OS。利用這項實驗結(jié)果將可以明確CTCs臨床檢測和治療方案更換的意義，而這也可以預(yù)測在肺癌領(lǐng)域CTCs對于治療方案變更的價值。

目前CTCs對于肺癌預(yù)后和療效判斷的研究樣本量較少，而且肺癌CTCs的檢測方法和使用的腫瘤標(biāo)記物也不同，所以關(guān)于CTCs與肺癌預(yù)后關(guān)系的研究尚需通過大規(guī)模、多中心的隨訪研究進行驗證。

3.3 個體化治療應(yīng)用 近年來基因診斷指導(dǎo)腫瘤個體化治療的研究越來越受重視，由于晚期或非手術(shù)腫瘤患者組織標(biāo)本獲取困難，使基因檢測在一定程度上受到限制，而且研究[41]發(fā)現(xiàn)由于腫瘤的異質(zhì)性，腫瘤的演變過程中存在進化，原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移灶可能存在基因型的改變。因此，在腫瘤個體化治療過程中實施動態(tài)監(jiān)測原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細胞及其基因變化成為亟需解決的問題。CTCs作為兩者之間的橋梁，能同時反映原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的性質(zhì)，在個體化治療中起重要作用。

EGFR的突變可以預(yù)測肺癌對于TKI靶向藥物的療效，在肺癌的個體化治療中起著重要作用[42]。由于CTCs檢測技術(shù)的局限，研究者首先想到利用血液循環(huán)中游離的腫瘤循環(huán)DNA進行檢測肺癌EGFR突變。Kimura等[43]使用擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplified refractory mutation system,ARMS）的方法檢測了NSCLC患者的腫瘤組織和血清的EGFR突變信息并進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有較高的一致率（72.7%），這可能由于血清中游離DNA主要來自CTCs的凋亡所造成的。隨著CTCs檢測技術(shù)的不斷進步，研究者開始利用CTCs自身來進行EGFR突變檢測。Maheswaran等[9]利用CTC-Chip技術(shù)將NSCLC患者血液中的CTCs收集并提取DNA，再利用ARMS法檢測其EGFR突變類型，其與原發(fā)腫瘤突變吻合率高達92%，明顯高于血漿游離DNA突變吻合率。而且在肺癌患者CTCs的基因檢測中發(fā)現(xiàn)20號外顯子T790M位點突變與TKI藥物耐藥有明顯關(guān)系，并且明顯降低了患者PFS。這充分說明CTCs的檢測可以在個體化治療的過程中動態(tài)的監(jiān)測腫瘤細胞及其EGFR基因變化。

隨著靶向基因的不斷涌現(xiàn)，肺癌CTCs也可用于其他生物標(biāo)記物的檢測，優(yōu)化個體化治療方案。最近的研究[44]中，研究者利用FAST系統(tǒng)檢測晚期NSCLC患者CTCs中核苷酸切除修復(fù)交叉互補組1（excision repair cross complement group 1, ERCC1）的表達，發(fā)現(xiàn)ERCC1在NSCLC患者CTCs表達水平與鉑類藥物化療療效和生存期呈負(fù)相關(guān)，提示CTCs可用于預(yù)測鉑類化療的療效和患者生存期。研究者[36]還應(yīng)用CellSearch系統(tǒng)檢測了SCLC患者外周血中的CTCs，并分析了死亡細胞血清標(biāo)記物。結(jié)果提示在局限期及廣泛期SCLC患者外周血均可檢出CTCs，并通過檢測CTCs中CD56證實其為腫瘤來源，提示CTCs及細胞死亡血清學(xué)標(biāo)記物有可能成為促進藥物開發(fā)的藥效學(xué)標(biāo)記。

CTCs對肺癌個體化治療具有潛在重大意義，可以實時、動態(tài)的檢測肺癌患者的分子學(xué)類型，反映腫瘤的生物學(xué)狀態(tài)，為患者個體化治療提供理論基礎(chǔ)和臨床證據(jù)。但能否完全代替原發(fā)組織標(biāo)本指導(dǎo)分子靶向治療，尚需大規(guī)模的前瞻性研究來證實。

4 困惑與障礙

自從CTCs發(fā)現(xiàn)以來人們不斷研究其在腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中的作用，F(xiàn)idler等[45]采用放射性碘標(biāo)記腫瘤細胞注入動物體內(nèi)，24 h后只有0.1%的腫瘤細胞保持存活，而形成轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞不到0.01%。為了解釋腫瘤轉(zhuǎn)移效率低這一現(xiàn)象，近年逐漸形成上皮- 間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition, EMT）理論。EMT最初定義為在胚胎時期上皮細胞喪失其上皮特性而獲得間充質(zhì)細胞特性的過程，其在胚胎干細胞分化過程中起著關(guān)鍵作用[46]。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者中隨著腫瘤細胞不斷增殖，部分細胞也會出現(xiàn)EMT，導(dǎo)致上皮表型標(biāo)志E-鈣粘素表達下降，而波形蛋白、成纖維細胞特異性蛋白-1等間充質(zhì)表型特征分子上調(diào)，致使細胞失去極性，粘附能力下降，運動能力增強，造成腫瘤細胞脫落于局部，一部分由于參與細胞結(jié)構(gòu)組成的上皮細胞結(jié)構(gòu)蛋白的缺失，致使細胞結(jié)構(gòu)松弛變形，然后侵入結(jié)締組織間隙并穿過基底膜進入血液循環(huán)系統(tǒng)，另一部分細胞由于腫瘤擴張生長，毛細血管破裂，直接進入血液系統(tǒng)，形成CTCs[47]。這就說明了腫瘤CTCs可能存在異質(zhì)性，需要更多的生物標(biāo)記物來檢測。而極少數(shù)逃過免疫反應(yīng)和凋亡的CTCs通過間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal-epithelial transition, MET）重新獲得上皮表型或者通過形成CTM在毛細血管末端形成癌栓，突破血管屏障，從而形成轉(zhuǎn)移灶。De Wever等[48]研究發(fā)現(xiàn)CTCs檢測困難可能是由于EMT過程中形成間質(zhì)性CTCs，其在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。Iwatsuki等[49]利用腫瘤患者外周血中CTCs找出于5個與EMT相關(guān)的基因。這不僅可以作為一種新型檢測CTCs的基因靶點，而且也進一步驗證了EMT在CTCs形成過程中的重要性。除此之外腫瘤干細胞等理論的存在，都表明僅僅依靠上皮細胞特異的生物標(biāo)記物或者單一的生物標(biāo)記物并不能代表腫瘤CTCs的全部特征。還需要更多關(guān)于腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的分子和遺傳機制的深入研究，以達到提高檢測技術(shù)的特異性和敏感性的目的，使其應(yīng)用于臨床。

5 展望

綜上所述外周血CTCs檢測在肺癌轉(zhuǎn)移的早期診斷和預(yù)后預(yù)測方面具有重要意義，其可以指導(dǎo)分子靶向藥物的應(yīng)用、評估治療療效。雖然外周血CTCs檢測方法進步迅速，但仍有以下問題值得注意：①具有高特異性和敏感性的技術(shù)仍是應(yīng)用于臨床檢測的關(guān)鍵，臨床檢測CTCs的技術(shù)仍要改善；②更多、更特異的生物標(biāo)記物，特別是基于EMT、腫瘤干細胞和CTM等CTCs理論相關(guān)的生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，有助于提高肺癌CTCs檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性；③進一步深化肺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子和遺傳機制研究，將有助于提高CTCs檢測的預(yù)測性和指導(dǎo)性，并有可能成為新抗肺癌藥物開發(fā)和篩選的基礎(chǔ)；④在兼顧準(zhǔn)確性的同時也要選擇盡量簡單、易行、花費小的方法，將有助于CTCs盡快的進入臨床。CTCs的檢測和研究將有助于提高肺癌患者的生活質(zhì)量和生存時間，必將成為臨床肺癌診治的必要手段。