瓊脂糖凝膠中DNA檢測方法的研究進(jìn)展

尤偉靜，陳茂，馬衛(wèi)德，叢維濤，金利泰

作為研究生命遺傳物質(zhì)載體——核酸的工具，瓊脂糖凝膠電泳已成為高效分離和分析核酸分子的必備手段，而在電泳后對 DNA 的檢測是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因?yàn)樗苯雨P(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯現(xiàn)與否。目前，常用的瓊脂糖凝膠上 DNA 檢測方法有熒光染色法、染料染色法、金屬離子染色法、負(fù)染法等。近幾十年來，許多研究者對染色方法進(jìn)行了改進(jìn)，使靈敏度和線性動態(tài)范圍都有較大程度提高。本文主要對瓊脂糖凝膠電泳后的 DNA 檢測技術(shù)方面的研究歷程進(jìn)行總結(jié)，并展望其未來的發(fā)展方向。

1 各種 DNA 染色方法

1.1 熒光染色法

熒光染色法是檢測 DNA 的一種常用分析技術(shù)。目前，用于瓊脂糖凝膠上 DNA 研究和測定的熒光染色方法有Hoechst 33258、Pico Green[1]、YOYO、TOTO[2]、EB 染色法[3]、生物素染料染色法[4]、DAPI[5-6]、SYBR Green I 染色法[7-10]、SYBR Gold 熒光染色法[11]等。

LePecq 和 Paoletti[12]觀察到 EB 染料與 DNA 結(jié)合時其熒光性增強(qiáng)的現(xiàn)象，此后在 1973 年，Sharp 等[13]首次將EB 法引入電泳凝膠上 DNA 的檢測，并獲得較好的效果，自此該檢測方法就被廣泛地應(yīng)用于 DNA 的研究[14]。EB 染色法作為瓊脂糖凝膠上 DNA 檢測最經(jīng)典的染色方法，具有操作快速、簡便，對 DNA 專屬性高，同時可滿足大部分的實(shí)驗(yàn)要求。但它卻具有兩個比較嚴(yán)重的缺點(diǎn)：①EB 能嵌入 DNA 分子雙螺旋結(jié)構(gòu)中破壞 DNA 樣品，從而具有較強(qiáng)的致畸、致突變作用，對實(shí)驗(yàn)操作者具有潛在危險(xiǎn)；②EB 檢測的凝膠需要在紫外燈下進(jìn)行檢識，而紫外射線常常導(dǎo)致核酸雜交、聚合[15-16]，對其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。Naimski 等將前人的 DAPI 染色法進(jìn)行改進(jìn)，通過優(yōu)化操作步驟與條件來增加其靈敏度，他們最終優(yōu)化的結(jié)果可使其靈敏度超過EB 熒光染色法[5-6]。

離子對技術(shù)應(yīng)用于 DNA 檢測是其檢測方法學(xué)上的一大理論突破。通常應(yīng)用于 DNA 檢測的染料都帶有銨根離子和芳香環(huán)，染料的銨根離子可與 DNA 的磷酸根離子通過靜電作用相互結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對 DNA 的染色。此方法不足之處在于銨根離子同時還會與瓊脂糖中的硫酸根離子以及碳酸根離子結(jié)合，使得背景顏色較深，從而導(dǎo)致染色結(jié)果對比度較差[8,17]。而離子對理論的提出有望改善這一情況，提高靈敏度并降低凝膠背景。離子對檢測技術(shù)的原理是通過采用兩種相反電荷的染料，正、負(fù)離子染料在溶液中可形成疏水性離子對，使得染色液中游離存在的染料濃度降低，從而提高染料對 DNA 的選擇性，增加 DNA 條帶與背景的對比度，最終提高檢測的靈敏度。同時，離子對染色法不需要脫色步驟，可使檢測時間相對縮減。Choi 等[8,17]將離子對技術(shù)運(yùn)用于 DNA 熒光染色，在增加靈敏度的同時還可避免 EB 的致畸作用。他們將小檗堿（BB）/媒染黃3R（MY3R）離子對染料運(yùn)用于瓊脂糖上 λDNA/HindIII 的檢測，其靈敏度為 10 ng 左右，雖比 EB 染色方法低兩倍，但比常用的亞甲基藍(lán)染色方法高兩倍[18]，兩者染料結(jié)構(gòu)見圖 1、圖 2。

圖 1 Berberine 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖 2 Mordant Yellow 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

近來人們將花青素類染料大量地應(yīng)用于各研究領(lǐng)域，如：作為細(xì)胞、微團(tuán)、組織[19-22]的熒光標(biāo)記和探針、蛋白檢測[23-24]、DNA 測序[25-26]、毛細(xì)管和凝膠電泳上核酸的定量分析[27-29]等。Hila 和 Taylor[4]對 23 種花青素染料進(jìn)行篩選，最終發(fā)現(xiàn)了 5 種花青素染料可用于 DNA 檢測，并比EB 染色法具有更高的靈敏度。

在對 DNA 染料進(jìn)行篩選時，靈敏度是其中一個重要的指標(biāo)，Schneeberger等[10]采用 SYBR Green I 對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其靈敏度與 EB 相比具有較大的提高。同時，Vitzthum 等[9]用 SYBR Green I 對瓊脂糖凝膠上的DNA 進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示其靈敏度可達(dá)到 20 pg，表明SYBR Green I 在 DNA 定量檢測方面也是一種優(yōu)良的檢測試劑。另外，用 SYBR Green I 對瓊脂糖凝膠上的 dsDNA進(jìn)行檢測，通過對體系條件（染料濃度、染色時間、染料與樣品的比例等）的優(yōu)化，得到最佳熒光強(qiáng)度條件，結(jié)果顯示其靈敏度比 EB 高 6 ～ 8 倍，同時證明了 SYBR Green I染料對 dsDNA 有較強(qiáng)的專屬性[9-10]。

SYBR Gold 熒光染料對瓊脂糖凝膠上的 DNA 檢測，可通過三種不同檢測方式進(jìn)行，包括電泳前染色、電泳與染色同時進(jìn)行和電泳后染色。Suenaga 和Nakamura[11]將這三種染色方式進(jìn)行比較，結(jié)果顯示電泳前染色所得到的效果比其余兩種方式要好，并且其靈敏度比 EB、SYBR Green I 都要高，但該染料存在著價格昂貴的缺點(diǎn)，并且其染色效果受較多外界因素（例如：染料-DNA 濃度比例、染料-DNA 配對比例等）的影響。

同時，Kirsanov 等[30]研究發(fā)現(xiàn) SYBR Gold 和 SYBR Green II 在 Ames 試驗(yàn)中不具有變異性，該結(jié)果可為未來染料的安全性檢測提供參考。近幾年，SYBR Gold 熒光染料在實(shí)時 PCR 的研究中也有較快發(fā)展[31]。

2010 年，Huang 等[32]研發(fā)的 GelRed 無論是在預(yù)制凝膠染色還是在凝膠電泳后染色，都表現(xiàn)出了極高的靈敏度。在凝膠電泳后染色中優(yōu)于或者至少相當(dāng)于 SYBR Gold，但與 SYBR Gold 不同，GelRed 在預(yù)制凝膠中使用時仍然有極高的靈敏度。

1.2 染料染色法

熒光染色方法雖然具有較高的靈敏度，但其染色后的凝膠需要紫外透射儀進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取，使得 DNA 染料染色法成為常規(guī)實(shí)驗(yàn)選用的檢測技術(shù)。常用的 DNA 染料染色法主要有亞甲基藍(lán)[33]、亮甲酚藍(lán)[34]、乙基紫[35]和尼羅藍(lán)[36]等，但是這些染料染色方法或需要較長的脫色時間（約 1 h），或靈敏度較低，或兼具兩個缺點(diǎn)。因此，Yong 等[37]將尼羅藍(lán)染色法進(jìn)行改進(jìn)，他們通過優(yōu)化染色的順序（先凝膠電泳，然后再染色），使其靈敏度有很大的提高。雖然該方法與 EB相比，其靈敏度仍較低[34,37]，但因尼羅藍(lán)染色方法的低毒性使得它在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用方面具有較好的實(shí)用性。

Yang 等[38]將結(jié)晶紫（CV）/甲基橙（MO）離子對染料應(yīng)用于瓊脂糖上的 DNA 檢測：（0.0025% CV，0.0005%MO，pH 6 ～ 7），在 30 min 內(nèi)即可完成對 3 kb DNA 的檢測，其靈敏度為 8 ng。兩者染料結(jié)構(gòu)見圖 3、圖 4。Hwang等[7]采用吲哚因藍(lán)（IB）/甲基橙（MO）離子對染料對瓊脂糖上的 DNA 進(jìn)行檢測：（0.008% IB、0.002% MO、10% 乙醇、0.2 mol/L 醋酸鈉、pH 4.7），可在 60 min 內(nèi)完成對λDNA/HindIII 的檢測，其靈敏度可達(dá) 5 ng。兩者染料結(jié)構(gòu)見圖 4、圖 5。

1.3 銀染法

銀染法是迄今為止靈敏度最高的一種 DNA 染色法，該染色法廣泛應(yīng)用于聚丙烯酰胺凝膠上 DNA 的檢測，其基本原理是銀離子與 DNA 分子上的磷酸基團(tuán)結(jié)合，然后結(jié)合的銀離子被還原為金屬銀，可使 DNA 呈現(xiàn)深棕色至黑色。銀染后的凝膠還可干燥、保存，但經(jīng)銀染后的 DNA不能回收，因此這種染色方法只能用于進(jìn)行 DNA 分析，而不能用于 DNA 的制備與分離[39-40]。

圖 3 結(jié)晶紫的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖 4 甲基橙的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖 5 吲哚因藍(lán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)

近年來，也不斷有人嘗試將銀染法引入到瓊脂糖凝膠上DNA 的檢測，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示染色背景太深，較難觀察到 DNA 條帶[18,41]。Gottlieb 和 Chavko[40]將前人的銀染法進(jìn)行改進(jìn)，對瓊脂糖凝膠上的真核 DNA 進(jìn)行檢測，根據(jù)不同的樣品采用不同的緩沖液和電泳條件，結(jié)果表明該方法檢測真核生物 DNA 的靈敏度比 EB 高，可達(dá) 2.5 ng，并且對 5 ～ 30 ng 的單鏈和雙鏈 DNA 均具有很好的線性相關(guān)性。

盡管瓊脂糖上 DNA 銀染法具有較高靈敏度，但是其缺點(diǎn)也是非常顯著的，如：①可能造成很高的檢測背景，特別在水不夠純的情況下；②費(fèi)時費(fèi)力，操作步驟繁瑣；③費(fèi)用較高；④需接觸有毒的甲醛[41]等。因此，很多研究人員正不斷尋求安全、靈敏的染色方法來代替銀染法。

1.4 負(fù)染法

DNA 分子經(jīng)過大量化學(xué)試劑處理之后，其生物活性往往受到較大影響，為了盡可能地保留核酸的生物活性，Hardy等[16]研發(fā)了一種新的檢測方法——鋅咪唑負(fù)染法，其靈敏度為 5 ～ 60 ng。該染色法的原理主要是鋅離子與咪唑結(jié)合沉淀在膠面上，而在鋅-DNA-咪唑區(qū)域不生成沉淀，因此染色后 DNA 條帶區(qū)域是透明的。

2 結(jié)語及展望

圖 6 近 37 年時間里重要的瓊脂糖凝膠染色方法的時間進(jìn)程表

表 1 常用的幾種 DNA 檢測方法優(yōu)缺點(diǎn)的比較

瓊脂糖凝膠上 DNA 染色是核酸分析研究中的一個重要領(lǐng)域，目前其問題主要集中在如何提高染色靈敏度，如何使操作簡捷，如何降低試劑毒性和費(fèi)用等方面。前人雖經(jīng)過不懈努力取得一定進(jìn)展（圖 6），但仍然存在許多有待改進(jìn)之處（表 1）。例如：①染料染色法雖操作簡單，但其靈敏度還有待提高；②銀染法是目前公認(rèn)靈敏度較高的染色方法，但它的背景較深，操作步驟繁多，接觸的試劑毒性較大，雖進(jìn)行了不少改進(jìn)，但還不盡如人意；③雖然熒光染色法可以使靈敏度接近銀染，但熒光染色往往會改變凝膠中 DNA的性質(zhì)，給進(jìn)一步分析造成障礙，而且熒光染色的結(jié)果需要紫外透射儀才能夠觀察到；④負(fù)染法雖在一定程度上可以克服上述的某些缺點(diǎn)，但負(fù)染后膠條與背景的對比度往往不高，且負(fù)染后的條帶是透明的，不易進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

有效克服以上這些方面的缺陷已成為將來瓊脂糖凝膠上 DNA 檢測的發(fā)展方向。例如：如何在保持銀染法高靈敏度的同時，又能夠有效地降低染色背景，同時用無毒的化學(xué)物質(zhì)去代替有毒的物質(zhì)；針對熒光染色可能造成 DNA的化學(xué)性質(zhì)改變的缺點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)；如何在保持負(fù)染法不破壞DNA 結(jié)構(gòu)優(yōu)勢的同時，增加其條帶與背景的對比度等。我們還可以嘗試在染色同時使用幾種染色方法，取長補(bǔ)短，達(dá)到最佳檢測效果。上述方面如果能夠得到改善，相信會對DNA 檢測方法的改進(jìn)帶來極大的影響。

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