攜帶miR29c重組腺病毒的制備及其促骨髓瘤細胞凋亡作用

張怡堃，王華，楊萍，李澤良，楊月峰，陳協群，王立生

自miRNA 被發(fā)現以來，已日益成為分子生物學研究的熱點。盡管已經取得了大量令人欣喜的成果，但在miRNA的生物發(fā)生、功能行為等眾多環(huán)節(jié)上仍有很多未解之謎[1-2]；這一方面要求我們謹慎地看待和應用已有的研究成果，另一方面要加快完善 miRNA 相關的基礎分子生物學機制的研究，尋找和開發(fā)更多適用于miRNA 研究的新技術，為全面理解 miRNA的生物學意義奠定更為牢固的基礎。

miR29c是我們通過 miRNA 微陣列生物芯片篩選獲得的在骨髓瘤細胞中高表達的miRNA，但是對于其在骨髓瘤中的功能研究鮮有報道。為更好研究其功能，我們構建了攜帶 miR29c的重組腺病毒，并利用流式細胞術檢測了其對骨髓瘤細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株、細胞和重組腺病毒 質粒：穿梭質粒 pShuttle-cmv、腺病毒骨架質粒 pAdEasy-1購自美國 Strategene公司；pcDNA3.0-miR29c 質粒由軍事醫(yī)學科學院鄭曉飛教授惠贈。

菌種：大腸桿菌 BJ5183 購自美國 Strategene公司、DH5a 感受態(tài)細胞購自北京博大泰克生物基因技術責任有限公司。

細胞：人骨髓瘤細胞系 SKO-007和U266（含10% 元亨血清的1640 培養(yǎng)基）、人骨髓瘤細胞系XG7 含 10% 元亨血清，3 ng/ml IL-6的1640 培養(yǎng)基）；HEK293 細胞（Ad5 E1 區(qū)轉化的人胚腎細胞）為本室保存。

重組腺病毒：重組腺病毒 Ad5F11p-EGFP、Ad5F11p 為本室構建制備。

1.1.2 主要試劑 動物基因組抽提試劑盒MagExtractor-Genome、高保真 DNA 聚合酶 KOD-plus 購自日本 Toyobo公司；離心柱型質粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒，脂質體 2000、D2000 marker 購自北京天根生物技術有限公司；限制性內切酶 PacI、PmeI 購自美國 Biolab公司；KpnI、EcoRV、HindIII、XbaI、小牛腸來源的堿性磷酸酶（CIAP）、λ/HindIII Marker 購自日本TaKaRa公司；RPMI 1640、DMEM 培養(yǎng)基購自美國 Sigma公司；FBS 購自美國 Hyclone公司和北京元亨圣馬生物技術研究所；其他試劑：胰酶、PBS 按分子克隆配制；瓊脂糖購自西班牙 Biowest Agarose Regular公司。

1.1.3 主要儀器 Mastercycler PCR 儀購自德國Eppendorf公司；倒置熒光顯微鏡和普通顯微鏡購自日本 Olympus公司；CCL-18 數碼成像系統(tǒng)購自日本 Nikon公司；紫外凝膠成像儀購自美國UVP公司；水平電泳系統(tǒng)購自北京六一儀器廠；高速冷凍離心機購自軍事醫(yī)學科學院儀器廠；DU640 型紫外分光光度計購自美國 Beckman公司；2300 型 CO2氣體培養(yǎng)箱購自美國 Thermo公司；高速臺式離心機購自美國 Heraeus公司。

1.2 方法

1.2.1 攜帶 miR29c 基因腺病毒載體的構建 以pcDNA3.0-miR29c 為模板設計引物，于兩端分別連接酶切位點 KpnI和EcoRV，PCR 擴增獲取miR29c 基因。引物：上游：5' gggggTACCgAggATgC CCTggAgTATTC 3'；下游：5' ggggATATCCATgATC TTCCTTCCCTATTC 3'；擴增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 25 s，50 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，6個循環(huán)；94 ℃25 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，25個循環(huán)；68 ℃ 4 min。穿梭質粒 pShuttle-CMV 與miR29c 基因分別進行 KpnI和EcoRV 雙酶切后，T4 DNA 連接酶于16 ℃ 連接過夜，轉化 DH5α 感受態(tài)細胞，Kana+LB 平板篩選 pShuttle-CMV-miR29c。pShuttle-CMV-miR29c 酶切鑒定正確后送北京奧科生物技術有限公司測序。測序鑒定正確的穿梭質粒pShuttle-CMV-miR29c 經 PmeI 酶切后線性化，CIAP 去磷酸化并割膠純化。純化產物以 200 ?，2.5 kV，25 μF的條件，電擊轉化含有 Ad5F11p 骨架質粒的BJ5183 感受態(tài)細胞。Kana+篩選pAd5F11p-miR29c，PacI 酶切鑒定重組質粒。

1.2.2 重組腺病毒 Ad5F11p-miR29c的制備及鑒定 重組腺病毒質粒 pAd5F11p-miR29c 經 PacI酶切后，酚氯仿抽提純化，紫外分光光度法測定線性化質粒的濃度及純度。采用脂質體轉染方法，將其轉染人胚腎細胞 HEK293，10～12 d 觀察噬斑形成和細胞病變并收集病毒液。

病毒基因組DNA 提?。簩⒉《疽焊腥?HEK293細胞后，收集病變細胞，重懸于400 μl PBS 中；–70 ℃和37 ℃ 反復凍融 3 次后，12000 r/m 離心 5 min，收集上清；分別加入 21 μl 10 mg/ml的蛋白酶 K、21 μl 10% SDS 以及9 μl 0.5 mol/L EDTA，于37 ℃ 放置過夜；酚氯仿抽提獲取病毒基因組DNA。以病毒基因組DNA 為模板，PCR鑒定目的基因 miR29c的表達。

1.2.3 重組腺病毒 Ad5F11p-miR29c 及對照病毒 Ad5F11p-EGFP的擴增及滴度測定 將鑒定正確的Ad5F11p-miR29c 病毒液以及本室保存的Ad5F11p-EGFP 病毒液感染 HEK293 細胞，獲取大量病變細胞，重懸于少量培養(yǎng)上清中；于–70 ℃和37 ℃ 反復凍融 3 次，于4 ℃，3000 r/m 離心30 min，收集病毒上清。經氯化銫密度梯度離心收集病毒帶，過夜透析后將純化的病毒液分裝，–70 ℃保存。經快速 CPE 法和有限稀釋法[5]分別檢測病毒滴度。

1.2.4 重組腺病毒 Ad5F11p-EGFP 對骨髓瘤細胞感染效率檢測 重組腺病毒 Ad5F11p-EGFP 分別以 50、100、150、200和250 MOI 分別感染人骨髓瘤細胞系 SKO-007、U266和XG7。熒光顯微鏡和流式細胞術分別檢測細胞感染效率。

1.2.5 miR29c 對骨髓瘤細胞凋亡的影響 選擇最佳感染復數，以 Ad5F11p-miR29c 感染骨髓瘤細胞，Annexin-V/PI 雙標，經流式細胞術檢測細胞凋亡。

2 結果

2.1 成功構建攜帶 miR29c 基因的腺病毒載體pAd5F11p-miR29c

以 pcDNA3.0-miR29c 質粒為模板進行 PCR擴增，成功獲得 miR29c 基因（圖 1A）。將 miR29c基因插入到穿梭質粒 pShuttle-CMV，篩選得到pShuttle-CMV-miR29c。酶切鑒定結果顯示，KpnI和EcoRV 雙酶切出現 250 bp 左右條帶，與預期相符；PCR 擴增目的基因 miR29c，結果如圖 1B 所示，證實質粒正確。最終經北京奧科生物技術有限公司測序正確。表明已成功構建攜帶目的基因的穿梭質粒 pShuttle-CMV-miR29c。

經去磷酸化處理的線性化穿梭質粒 pShuttle-CMV-miR29c，電擊轉化含 Ad5F11p 骨架質粒的BJ5183 感受態(tài)細胞，Kana+篩選陽性克隆。PacI 酶切出現 2 條條帶，與Ad5F11p-EGFP 質粒的酶切產物一致，表明已成功獲得重組腺病毒質粒pAd5F11p-miR29c（圖 1C）。

圖1 pAd5F11p-miR29c 構建及鑒定Figure1 Construction and identification of pAd5F11pmiR29c

2.2 成功制備重組腺病毒 Ad5F11p-miR29c 并鑒定正確

圖2 HEK293 細胞噬斑產生及完全病變（A：細胞噬斑；B：完全病變）Figure2 HEK293 cells with plaque forming and completely cytopathy (A: Plaque forming cells; B: Cells with completely cytopathy)

重組腺病毒質粒 pAd5F11p-miR29c 經 PacI線性化和酚氯仿抽提后，紫外分光光度計測定其OD260/OD280比值為1.892，質粒濃度為655μg/ml，均符合轉染條件。轉染細胞融合度達到 80% 以上的HEK293 細胞，9 d 出現噬斑，12 d 出現細胞完全病變（CPE）（圖 2）。

提取病毒基因組DNA，采用 miR29c 基因的引物進行 PCR 擴增，產物經 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，條帶大小為250 bp 左右，與目的條帶一致（圖3）。表明已經成功制備重組腺病毒 Ad5F11pmiR29c。

圖3 PCR 鑒定病毒基因組中 miR29c 表達電泳結果Figure3 Identification of recombinant adenoviral vectors carrying miR29c with PCR method

表1 流式細胞術檢測 Ad5F11p-EGFP 感染 48 h 后各細胞系 EGFP 表達Table1 EGFP expression after infection with Ad5F11p-EGFP in hemapoietic cell lines

2.3 重組腺病毒 Ad5F11p-EGFP 對骨髓瘤細胞感染效率的檢測

快速 CPE和有限稀釋法檢測重組腺病毒Ad5F11p-miR29c和Ad5F11p-EGFP的感染滴度，分別為1.56×1010和1.0×109。Ad5F11p-EGFP分別以 50、100、150、200、250 MOI 感染人骨髓瘤細胞系 SKO-007、U266、XG7和K562。感染后48 h，流式細胞術檢測綠色熒光蛋白 EGFP的表達，結果如表1 所示。

2.4 重組腺病毒 Ad5F11p-miR29c 可以介導miR29c 在骨髓瘤細胞中高表達

Ad5F11p-miR29c 以 150 MOI 感染 SKO-007和U266 細胞，以 100 MOI 感染 XG7 細胞。感染后48 h，qRT-PCR 檢測 miR29c的表達（圖 4）。結果表明，Ad5F11p-miR29c 感染后48 h，骨髓瘤細胞 SKO-007、U266和XG7 細胞中 miR29c的表達率明顯高于感染前。表明 Ad5F11p-miR29c能夠在造血細胞中有效表達。

圖4 Real-time PCR 檢測重組腺病毒 Ad5f11p-miR29c感染骨髓瘤細胞系 48h 后，miR29c 表達量的變化Figure4 Determination of miR29c levels in SKO-007，U266 and XG-7 cells 48 h after infection with Ad5F11p-miR29c by qRT PCR

2.5 過表達 miR29c 誘導骨髓瘤細胞的凋亡

用腺病毒 Ad5F11p-miR29c 以優(yōu)化后的感染復數 150 MOI 感染 SKO-007 細胞，100 MOI 感染 XG7 細胞，同時以未感染及以 Ad5F11p-null空病毒感染的細胞為對照，于感染后12、24、48 h，Annexin-V/PI 雙標后經流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果如圖 5、圖 6 所示，Ad5F11p- miR29c 感染后48 h，骨髓瘤細胞 SKO-007和XG7 細胞的凋亡率明顯高于感染前（未感染病毒的細胞凋亡率分別為SKO-0078.99%，XG75.62%；感染空病毒的細胞凋亡率分別為SKO-00711.2%，XG713.44%，而感染 Ad5F11p-miR29c 病毒的細胞凋亡率分別達到 SK0-00726.5%，XG746.9%）。表明過表達 miR29c 可誘導骨髓瘤細胞的凋亡。

圖5 Ad5F11p-miR29c 病毒感染 SKO-007（A）和XG7（B）細胞 12、24、48 h 后的流式檢測 Annexin V/PI 表達，同時以未感染病毒的細胞和用空病毒感染的細胞設為對照，為三次獨立的實驗結果的統(tǒng)計分析，采用 t 檢驗分析Figure5 Annexin V/PI assay in SKO-007 (A) and XG7 (B)cells after 12, 24 and 48 h infection with adenovirus miR-29c or controls (without infection or empty vector).The results are shown as percentage of apoptotic cells.Data are the average of three independent experiments±SD.P-values were obtained using t tests.

圖6 miR29c 誘導 SKO-007 細胞凋亡的代表性的流式圖Figure6 Flow cytometric analysis of apoptosis with Annexin V/PI staining in SKO-007cells

3 討論

miRNA是近年來發(fā)現的一種內源性非蛋白質編碼的約 22個核苷酸左右的單鏈小 RNA，具有高度的種間保守性和時空特異性。通過作用于靶基因的3′UTR（3′ 非翻譯區(qū)）在轉錄后水平調節(jié)靶基因的表達，廣泛地參與調節(jié)細胞增殖、分化、分泌和凋亡等生命活動[6]。miRNA的這些特點，為生物治療開拓了新的視野。通過基因療法手段控制miRNA 水平從而治療疾病就成為治療學進展中極具吸引力的一項新方法。

眾所周知，miRNA 參與人類多種疾病的形成過程，這就為疾病治療提供了新的潛在靶標。一直以來人們都在嘗試研究如何在體內特異地調節(jié)miRNA的水平。這么多年來在反義RNA、核酶以及一些基因治療方法上取得的研究成果為體內研究 miRNA 提供了一個良好的技術平臺和研究思路，但均各自存在缺陷和不足[7-9]。目前，利用miRNA 為基礎的生物治療的主要障礙就是如何有效地將 miRNA 或反義寡核苷酸 anti-miRNA 在體內導入靶細胞。因此，尋找有效的基因轉移載體成為眾多科研人員的研究重點。

理想的基因轉移載體不僅應具有將目的基因轉移到靶細胞的功能，還應該保證目的基因按時按量表達。重組腺病毒構建載體是目前應用最多的一種高效基因轉移載體[2-3]，宿主細胞范圍廣、插入外源基因穩(wěn)定、目的基因表達水平高、包裝容量大及不整合等優(yōu)點；腺病毒載體構建、制備簡單，容易制備高滴度病毒顆粒。我們前期已經利用纖維頂球替代改構方法構建了具有造血細胞靶向性的腺病毒載體系統(tǒng) Ad5F11p，該系統(tǒng)方便構建帶有不同功能基因的靶向腺病毒載體，大大地提高對造血細胞的感染效率，因而 Ad5F11p 為造血調控的基礎研究以及血液腫瘤的基因治療奠定基礎，是非常有用的腺病毒載體[3-4]。

本實驗選用血液細胞靶向性腺病毒 Ad5F11p作為載體，首先通過 PCR 方法獲得目的基因并在其兩端分別連接上酶切位點，隨后將目的基因miR29c 插入穿梭質粒的多克隆位點，通過酶切、PCR 擴增及測序三重鑒定，證實目的基因 miR29c已正確插入穿梭質粒 pShuttle-CMV 中。與含腺病毒 Ad5F11p 基因組的質粒 pAd5F11p 共轉染至BJ5183 細胞內進行同源重組，重組后轉染 HEK293細胞制備病毒，有重組病毒生成后形成的空斑大多為含有目的基因的陽性克隆。本實驗中，感染性試驗證明了腺病毒載體具有良好的感染活性。采用插入的miR29c 基因特異引物和腺病毒載體特異引物進行 PCR 鑒定，證明包裝的腺病毒基因組攜帶miR29c。利用帶有 GFP 對照基因的腺病毒載體Ad5F11p-GFP，初步檢測了其對 3 種骨髓瘤細胞系的感染效率，感染滴度在100～150 MOI 范圍內，感染效率均在90% 以上，體現了很好的造血細胞靶向性。用重組腺病毒感染 SKO-007等細胞后，通過 real-time PCR 證實腺病毒載體可以提高miR29c 在骨髓瘤細胞中的表達。利用腺病毒載體在骨髓瘤細胞中過表達 miR29c，發(fā)現過表達miR29c 可誘導骨髓瘤細胞的凋亡。本研究通過構建并制備攜帶 miR29c 目的基因的腺病毒，初步觀察了其對造血細胞的感染及對骨髓瘤細胞凋亡的影響，為進一步 miRNA 功能研究及基于miRNA的基因治療研究打下了基礎。

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