醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠預(yù)防兔硬膜外粘連的安全性研究

梁文鍇，郭全義，韓樹峰，張莉，彭江，劉舒云，梁增義，許文靜，盧世璧

硬膜外粘連是椎板切除術(shù)后常見的并發(fā)癥之一[1]，在預(yù)防硬膜外粘連的方法中，除了注意術(shù)中操作，以盡量減少出血及其他炎癥反應(yīng)外，局部應(yīng)用預(yù)防硬膜外粘連材料也得到廣泛關(guān)注[2]。

高分子量的透明質(zhì)酸具有局部抗炎，抑制成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)等作用[3-4]。因此已被廣泛應(yīng)用于預(yù)防硬膜外粘連，但是普通透明質(zhì)酸在體內(nèi)降解過快，遠(yuǎn)期預(yù)防粘連效果不佳。為克服這一缺點(diǎn)，現(xiàn)將透明質(zhì)酸分子進(jìn)行自交聯(lián)，使其變成整體的透明質(zhì)酸團(tuán)塊，在保留其基本的理化性質(zhì)的前提下，延長了體內(nèi)降解時間。雖然交聯(lián)后的透明質(zhì)酸已應(yīng)用于普外科、婦科等領(lǐng)域的防粘連中，但由于其交聯(lián)之后，黏稠度提高，所以將其應(yīng)用于椎板切除術(shù)后預(yù)防硬膜外粘連這個特殊領(lǐng)域時，是否會對脊髓的電生理產(chǎn)生影響，其安全性如何，本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行研究。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 材料 醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠（HyaRegen/SPI）由常州百瑞吉生物醫(yī)藥有限公司提供，生產(chǎn)批號：ENT 1002001，常溫避光保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 健康新西蘭大白兔 24 只，兔齡 4～5 個月，雄性，體重 2.5～3.0 kg。由解放軍總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，均飼養(yǎng)于清潔普通環(huán)境中。

1.1.3 儀器 體感誘發(fā)電位儀購自美國 CADWELL公司。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)經(jīng)過 3% 戊巴比妥鈉靜脈麻醉生效后，剔除兔腰骶部背毛，俯臥位固定于手術(shù)操作臺，腰骶部墊高。連接肌電圖儀，分別于兔雙后肢內(nèi)踝后方皮下刺入刺激電極（遠(yuǎn)）和參考電極（近），顱頂部（雙耳連線中點(diǎn)）皮下刺入記錄電極，雙眼連線中點(diǎn)皮下刺入?yún)⒖茧姌O，腮部皮下刺入地線；連接完畢后予首次電刺激，記錄麻醉后體感誘發(fā)電位（CSEP）潛伏期值。術(shù)區(qū)碘伏消毒后鋪單，以 L5棘突為中心做腰骶部正中切口，切口長度約 3 cm，暴露椎旁肌，鈍性剝離椎旁肌，暴露出 L5 椎板。用電磨鉆行 L5 椎板切除術(shù)，形成 5 mm × 8 mm硬脊膜暴露區(qū)，生理鹽水術(shù)區(qū)沖洗，出血處壓迫止血。此時行第 2 次電刺激，記錄椎板切除術(shù)后CSEP 潛伏期值。

剔除因手術(shù)操作損傷脊髓而導(dǎo)致 CSEP 異常的兔子，剩下的兔子按照處理方法不同隨機(jī)分為A、B、C、D 四組，A組（對照組）術(shù)區(qū)僅用生理鹽水沖洗；B組、C組、D組均為實(shí)驗(yàn)組：于硬脊膜暴露區(qū)覆蓋醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠，但劑量各不相同，分別為 0.5、0.75 和1.0 ml。動物在逐層閉合切口后，蘇醒前行第 3 次電刺激，記錄 CSEP 潛伏期值。術(shù)后動物允許籠中自由活動，單籠單兔，飼養(yǎng)條件同術(shù)前。

1.2.2 觀察指標(biāo)

1.2.2.1 體感誘發(fā)電位測定 各電極刺入體表位置如前所述，參數(shù)設(shè)定：持續(xù)刺激電極的頻率2.7 Hz，持續(xù)時間 200 ms；方波刺激脛神經(jīng)，刺激強(qiáng)度以略引起腓腸肌顫動為宜，信號疊加 200 次；過濾信號頻率：2～2000 Hz。每只動物均進(jìn)行 4 次CSEP 潛伏期值測定：除了上述 3 次測定外，動物在術(shù)后第 8 周在同前麻醉?xiàng)l件下行第 4 次 CSEP潛伏期值測定，觀察各組潛伏期值的變化。

1.2.2.2 對后肢運(yùn)動情況進(jìn)行評分 分別在術(shù)前、術(shù)后第 1 天及術(shù)后第 8 周對兔的后肢進(jìn)行運(yùn)動功能評分。采用 Tarlov 評分標(biāo)準(zhǔn)[5]：0 分：肢體完全癱瘓；1 分：后肢可水平劃動；2 分：后肢可以活動但不能負(fù)重；3 分：后肢可負(fù)重和行走，但不穩(wěn)；4 分：正常。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

動物均在術(shù)后約 40 min 內(nèi)清醒，自主飲水進(jìn)食。觀察期間無動物死亡。手術(shù)切口未見感染、切口愈合時間約為 7 d。

2.1 體感誘發(fā)電位

4 次 CSEP 測定 A、B、C、D 四組的潛伏期值詳見表 1，結(jié)果顯示：麻醉生效后首次 CSEP 測定，各組潛伏期值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）（圖 1）；行 L5 椎板切除術(shù)將硬脊膜完全暴露后的第 2 次 CSEP 測定顯示，各組潛伏期值均略有延長，但延長值均小于 10%，且各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）（圖 2）；各組在完成不同處理關(guān)閉切口之后的第 3 次 CSEP 測定顯示，A組（對照組）與 B組（0.5 ml組）潛伏期值均無明顯延長，且兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05），而 C組（0.75 ml組）和D組（1.0 ml組）的潛伏期值較前延長，且與 A組和B組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）（圖 3）；術(shù)后 8 周在相同麻醉?xiàng)l件下復(fù)測各組動物 CSEP 潛伏期值顯示：各組CSEP 潛伏期值均處于正常值范圍（C組和D組潛伏期值回歸至正常范圍），且各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）（圖 4）。

2.2 運(yùn)動功能評分

術(shù)前各組動物運(yùn)動功能評分（Tarlov 標(biāo)準(zhǔn)）均為 4 分；在術(shù)后第 1 天再次對各組動物進(jìn)行運(yùn)動功能評分后發(fā)現(xiàn)：A組（對照組）和B組（0.5 ml組）運(yùn)動功能評分同術(shù)前，但C組（0.75 ml組）和D組（1.0 ml組）其運(yùn)動功能評分均有不同程度的下降；在術(shù)后 8 周再次對各組動物運(yùn)動功能進(jìn)行評分后發(fā)現(xiàn)：其評分結(jié)果均為正常（表 2）。

表1 4 次 CSEP 測定 A、B、C、D 四組潛伏期值（n = 6）Table 1 Four time points of CSEP, the latency of group A, B, C, D (n = 6)

圖1 首次 CSEP 測定（麻醉生效后）：左側(cè)兩條波形為 A組（對照組）刺激動物雙脛后神經(jīng)形成的 CSEP 波形；右側(cè)從上至下分別為：B組（上兩條）、C組（中間兩條）、D組（下兩條）刺激動物雙脛后神經(jīng)形成的 CSEP 波形。測定各組潛伏期值（P1）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）Figure 1 CSEP was monitored in the first time (after anesthesia): the two waves on the left side were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group A.The waves on the right side from up to down were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group B (the upper two), group C (the middle two) and group D (the lower two)respectively.There were no significant difference of the latency (P1) between each group (P ＞ 0.05).

圖2 行 L5 椎板切除術(shù)將硬脊膜完全暴露后的第 2 次 CSEP 測定：各組潛伏期值（P1）均略有延長，但延長值均小于10%。左側(cè)兩條波形為 A組（對照組）刺激動物雙脛后神經(jīng)形成的 CSEP 波形；右側(cè)從上至下分別為：B組（上兩條）、C組（中間兩條）、D組（下兩條）刺激動物雙脛后神經(jīng)形成的 CSEP 波形。測定各組潛伏期值（P1）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）Figure 2 CSEP were monitored in the second time (after laminectomy): the latency (P1) of each group were all delayed slightly,but the value of prolongation were all under 10%.The two waves on the left side were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group A.The waves on the right side from up to down were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group B (the upper two), group C (the middle two) and group D (the lower two) respectively.There were no significant difference of the latency (P1) between each group (P ＞ 0.05).

3 討論

圖3 各組在完成不同處理關(guān)閉切口之后的第 3 次 CSEP 測定：A組（左側(cè)兩條波形）與 B組（右側(cè)上兩條波形）潛伏期值（P1）均無延長（P ＞ 0.05），C組（右側(cè)中間兩條波形）和D組（右側(cè)下兩條波形）的潛伏期值均延長，且與 A組（對照組）和B組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）Figure 3 CSEP were monitored in the third time (after wound closure): The waves of CSEP of group A (the two waves on the left side) and group B (the upper two waves on the right side) showed that the latency (P1) were not delayed in that two groups (P ＞0.05).In group C (the middle two waves on the right side) and group D (the lower two waves on the right side), however, the latency(P1) were delayed significantly compared with that of group A and group B (P ＜ 0.05).

圖4 第 4 次測定各組動物 CSEP（術(shù)后 8 周）：各組潛伏期值（P1）均在正常值范圍內(nèi)（P ＞ 0.05）。左側(cè)兩條波形為 A組（對照組）刺激動物雙脛后神經(jīng)形成的 CSEP 波形；右側(cè)從上至下分別為：B組（上兩條）、C組（中間兩條）、D組（下兩條）刺激動物雙脛后神經(jīng)形成的 CSEP 波形Figure 4 CSEP were monitored in the fourth time (at post-surgery 8 weeks): the latency (P1) of each group were all in the normal range (P ＞ 0.05).The two waves on the left side were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group A.The waves on the right side from up to down were produced by stimulating bilateral posterior tibial nerves of animals in group B (the upper two), group C (the middle two) and group D (the lower two) respectively.

表2 各組動物三次運(yùn)動功能評分結(jié)果（n = 6）Table 2 The results of three times of motor scoring of each group (n = 6)

硬膜外粘連是發(fā)生腰椎手術(shù)失敗綜合征（failed back surgery syndrome）的重要原因之一[6]。因此多種生物材料被應(yīng)用于粘連的預(yù)防當(dāng)中，透明質(zhì)酸就是其中的一種。然而普通的透明質(zhì)酸在體內(nèi)降解速度較快，遠(yuǎn)期預(yù)防粘連效果欠佳，為克服這一缺點(diǎn)，各學(xué)者或?qū)⑼该髻|(zhì)酸制成膜[7]，或與其他自體組織聯(lián)合應(yīng)用[8]，以延長體內(nèi)降解時間。本實(shí)驗(yàn)中所應(yīng)用的醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠是將普通透明質(zhì)酸分子自交聯(lián)，從而延長其體內(nèi)降解時間。但較高的自交聯(lián)程度導(dǎo)致了該生物材料黏稠度的提高，因此將其應(yīng)用于椎板切除術(shù)后預(yù)防硬膜外粘連這個特殊領(lǐng)域時，是否會對脊髓的電生理產(chǎn)生影響，其安全性值得研究。

CSEP 是測定脊髓損傷的敏感指標(biāo)[9]。Su 等[10]通過運(yùn)用 CSEP 來檢測硬膜外局部用藥的安全性，同理，本實(shí)驗(yàn)也采用 CSEP 來測定不同劑量的HyaRegen/SPI 對脊髓電生理功能的影響。CSEP 運(yùn)用在術(shù)中監(jiān)控，若潛伏期延長 10% 以上，或波幅下降 50%，則為報警閾值[11]。因此本實(shí)驗(yàn)采用術(shù)中CSEP 監(jiān)控，能及時剔除手術(shù)操作損傷脊髓的兔子，保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的客觀性和準(zhǔn)確性。根據(jù)文獻(xiàn)[12-13]報道，CSEP 波幅的變化差異和變異較大，而 CSEP 潛伏期值更為敏感和可靠，本實(shí)驗(yàn)過程中也同樣發(fā)現(xiàn)，在相同麻醉?xiàng)l件下時，未行任何手術(shù)操作時，各組動物的 CSEP 波幅就已表現(xiàn)的極為不穩(wěn)定，而潛伏期值則較為穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)中主要以 CSEP 潛伏期值作為觀察指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：行椎板切除術(shù)暴露出硬脊膜之后，即刻 CSEP潛伏期值在各組均略有延長，但均小于 10%，因此并不考慮為手術(shù)損傷，考慮為溫度較低的生理鹽水沖洗術(shù)區(qū)所致，且在對照組（A組）和HyaRegen/SPI 0.5 ml組（B組）閉合切口之后，均恢復(fù)至正常值，這與徐印坎等[11]的研究一致。

各組完成不同的處理之后逐層關(guān)閉切口，測各組 CSEP，結(jié)果顯示：A組（對照組）和B組（覆蓋 HyaRegen/SPI 0.5 ml）的潛伏期值無延長（P ＞0.05），但是C組（覆蓋 HyaRegen/SPI 0.75 ml）和D組（覆蓋 HyaRegen/SPI 1.0 ml）的潛伏期值出現(xiàn)延長（P ＜ 0.05），結(jié)合次日運(yùn)動功能評分結(jié)果（A組、B組正常，而 C組、D組評分下降），說明 C組和D組動物的脊髓受到了壓迫，但產(chǎn)生這種壓迫作用的原因可能有 3 種：①肌層的閉合會使肌層與暴露出的硬脊膜之間的空間縫隙變小，而透明質(zhì)酸鈉凝膠正是位于這個空間縫隙內(nèi)。若透明質(zhì)酸鈉凝膠的劑量偏大，則其體積也相應(yīng)增大，在肌層與硬脊膜之間的狹小空間內(nèi)就會受到擠壓力，在這種擠壓力作用下，透明質(zhì)酸鈉凝膠突向較柔軟的脊髓組織，從而對其產(chǎn)生壓迫作用。若手術(shù)切口長度加大，軟組織剝離范圍加大，椎板切除面積也加大，則肌層與暴露出的硬脊膜之間的空間縫隙就會相應(yīng)增大，那么脊髓可承受的透明質(zhì)酸鈉凝膠的劑量也就相應(yīng)增大，但它們之間的具體關(guān)系仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。②本實(shí)驗(yàn)選用新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)動物，在這種四足行走的動物中，透明質(zhì)酸鈉凝膠的重力方向與動物脊髓呈垂直關(guān)系，若透明質(zhì)酸鈉凝膠的劑量偏大，則質(zhì)量增大，垂直壓迫脊髓的重力也相應(yīng)增大，因此產(chǎn)生壓迫作用。但在雙足直立行走的動物（如：人），透明質(zhì)酸鈉凝膠的重力方向與動物脊髓呈平行關(guān)系，則有可能不會對脊髓產(chǎn)生壓迫，對此仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。③是上述兩種作用力的綜合作用。

在術(shù)后 8 周復(fù)測 CSEP 及運(yùn)動評分發(fā)現(xiàn)：各組 CSEP 潛伏期值均處于正常值范圍（P ＞ 0.05）；運(yùn)動評分也均正常。此時考慮 0.75 ml組（C組）和1.0 ml組（D組）的透明質(zhì)酸凝膠已被代謝，局部壓迫解除，使脊髓電生理功能及運(yùn)動功能恢復(fù)正常。

通過該實(shí)驗(yàn)我們認(rèn)為：對于該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?.5 ml的醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠是一個安全劑量，局部應(yīng)用之后不會對脊髓造成壓迫，不會影響其電生理功能及后肢運(yùn)動功能，而 0.75 ml 和1.0 ml 的局部用藥劑量偏大，會對脊髓產(chǎn)生壓迫，因此不推薦使用該劑量進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。但0.5 ml 的醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠是否能夠有效地預(yù)防椎板切除術(shù)后硬膜外粘連，則需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。同時本實(shí)驗(yàn)也提示我們：任何應(yīng)用于脊髓硬膜外的植入材料，在考慮其生物相容性、毒性作用[10]的同時，必須同時要考慮在此特殊部位，植入材料的物理特性對局部組織的危害。但至于這種物理特性產(chǎn)生局部組織危害的機(jī)制及它們之間的具體關(guān)系則需進(jìn)一步研究。在實(shí)際的科學(xué)研究中，藥物或器械的化學(xué)毒性是藥物或器械研發(fā)人員最關(guān)心的，而臨床醫(yī)師的關(guān)心點(diǎn)在于藥物或器械對局部微環(huán)境的影響及操作使用的可行性，因此只有科研和臨床的結(jié)合才會出現(xiàn)具有臨床應(yīng)用價值的產(chǎn)品。因此綜上所述，若想要將該透明質(zhì)酸鈉凝膠應(yīng)用于人體，其應(yīng)用劑量及安全性問題則需要更多的動物實(shí)驗(yàn)甚至臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

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