羅布泊來源脹果甘草根際枯草芽孢桿菌GA21次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與活性初步研究

靳婧，旭格拉·哈布丁，劉少偉，郭琳，蔣忠科，欒迎春，李展先，潘臻，孫承航

特殊生態(tài)環(huán)境，尤其是極端環(huán)境是發(fā)現(xiàn)新微生物資源及新活性分子的寶庫，近年來對(duì)這一寶庫的資源勘探和新活性分子的發(fā)掘，在國(guó)際上已成為新的研究熱點(diǎn)[1-3]，針對(duì)這一研究熱點(diǎn)，我們對(duì)來源于有地球“旱極”之稱的羅布泊[4]及周邊地區(qū)的微生物藥用資源開展了勘探和藥物篩選的研究工作，其中在以水稻稻瘟菌為檢定菌，對(duì)沙生植物脹果甘草根際土壤分離出的一批放線菌和芽孢桿菌進(jìn)行活性篩選過程中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌 GA21 的發(fā)酵液具有較強(qiáng)抗真菌活性。本文報(bào)道了枯草芽孢桿菌GA21 的培養(yǎng)，GA21-20 和GA21-26 的分離純化，GA21-20 的譜學(xué)數(shù)據(jù)以及新化合物 GA21-26的抗真菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株 GA21 經(jīng) 16S rRNA 測(cè)序及NCBI 數(shù)據(jù)庫 BLAST 比對(duì)表明 GA21 與菌株Bacillus Subtilis strain 47-B-41 核糖體堿基序列相似性為 100%，鑒定為枯草芽孢桿菌。

1.1.2 植物病原真菌 水稻稻瘟菌（Pyricularia oryzae）由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院夏湛恩研究員饋贈(zèng)。

1.1.3 培養(yǎng)基 GA21 的斜面、種子和發(fā)酵培養(yǎng)基均為改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基（可溶性淀粉 20 g，氯化鈉 50 g，磷酸氫二鉀 0.5 g，硝酸鉀 1 g，硫酸鎂 1 g，硫酸亞鐵 0.02 g，葡萄糖 1 g，蛋白胨 0.5 g，胰蛋白胨 0.3 g，蒸餾水 1000 ml，10% 無水碳酸鈉調(diào) pH 8.0）。

水稻稻瘟菌培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）由廣東環(huán)凱生物科技有限公司提供。

白色念珠菌培養(yǎng)基 沙堡培養(yǎng)基（SDA 培養(yǎng)基）（麥芽糖 40 g，蛋白胨 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 ml，調(diào) pH 6.0）。

大腸桿菌培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B 培養(yǎng)基（酵母提取物 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1000 ml，調(diào) pH 7.5）。

1.1.4 試劑 分析純乙酸乙酯、甲醇等均為北京化工廠生產(chǎn)；色譜級(jí)甲醇購于美國(guó) Honeywell Burdick & Jackson 公司；水為屈臣氏蒸餾水。

1.1.5 分離填料 TLC 板、Silica gel 60 F254 鋁箔板及玻璃板為德國(guó) Merck 公司產(chǎn)品；高效液相色譜半制備柱 Zorbax SB-C18（9.4 mm × 250 mm，5 μm）和高效液相色譜分析柱 Zorbax SB-C18（9.4 mm × 150 mm，5 μm）均為美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品。

1.1.6 儀器 高效液相色譜儀 Agilent 1200 series為美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；Linomat 5 TLC 板半自動(dòng)點(diǎn)樣儀為瑞士卡瑪公司產(chǎn)品；Varian VNS-600 核磁共振分析儀為瑞士瓦里安公司產(chǎn)品；Christ RVC 2-18 型離心濃縮機(jī)為德國(guó) Christ 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 GA21 菌株的發(fā)酵 將生長(zhǎng)良好的菌株GA21 斜面接種至含 50 ml 種子培養(yǎng)基的 250 ml三角瓶中，置于 28 ℃、180 r/min 搖床上旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng) 24 h，然后轉(zhuǎn)接于含 1000 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基的5000 ml 三角瓶中，28 ℃、180 r/min 搖床上旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng) 48 h，收獲發(fā)酵液。

1.2.2 活性檢測(cè)方法

⑴以稻瘟菌為檢定菌，其斜面培養(yǎng)基為 PDA瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為 28 ℃，培養(yǎng) 4 d。用接種環(huán)刮取菌苔并轉(zhuǎn)移至消毒后的磨菌器，磨菌器中加入 2 ml 生理鹽水，磨菌后獲得的稻瘟菌懸液以1% 接種量轉(zhuǎn)移至約 40 ℃ 的 PDA 瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后，以 10 ml/皿迅速分裝于已鋪有 10 ml PDA 瓊脂培養(yǎng)基的 90 mm 培養(yǎng)皿中，凝固后，將浸有已風(fēng)干待測(cè)樣品的 6 mm 圓形紙片貼于檢定平板上，置于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 d，觀察結(jié)果。

⑵以白色念珠菌為檢定菌，其培養(yǎng)基為 SDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為：28 ℃，培養(yǎng) 12 h。用接種環(huán)在白色念珠菌斜面培養(yǎng)基上刮取少量菌苔到SDA 液體培養(yǎng)基中，白色念珠菌液以 5% 接種量轉(zhuǎn)移至約 40 ℃ 左右的 SDA 培養(yǎng)基中，混勻后，以 10 ml/皿迅速分裝于已鋪有 10 ml SDA 培養(yǎng)基的 90 mm 培養(yǎng)皿中，凝固后，將浸有已風(fēng)干待測(cè)樣品的 6 mm 圓形紙片貼于檢定平板上，置于 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12 h，觀察結(jié)果。

⑶以金黃色葡萄球菌，大腸桿菌為檢定菌，培養(yǎng)基均為 LB 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件和活性測(cè)定方法同上。

1.2.3 GA21-20 和GA21-26 的分離純化 GA21菌株發(fā)酵液（10 L）經(jīng) 4000 r/min 離心 15 min，獲得發(fā)酵產(chǎn)物上清液，以等體積乙酸乙酯萃取上清液，萃取液經(jīng)無水硫酸鈉脫水，減壓濃縮，獲得粗品。粗品用半自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于硅膠板（10 cm ×10 cm），氯仿∶甲醇 = 4∶1 展開，200 μl/板 × 27 板。取其中一塊點(diǎn)樣展開后的硅膠鋁箔板，按展開方向切下 8 mm 左右條帶，在稻瘟菌平板上測(cè)活，根據(jù)活性點(diǎn)的比移值，在紫外燈下將其余展開后的制備薄層板上同樣比移值的條帶刮下，并裝于小玻璃柱（15 cm × 1.5 cm），用適當(dāng)體積的甲醇進(jìn)行洗脫，將洗脫液減壓濃縮，濃縮后，用少量甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm 過濾膜過濾后的樣品，進(jìn)一步用反相半制備高效液相柱純化，制備條件如下：流動(dòng)相為 55%甲醇水溶液，流速為 2 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm，收集保留時(shí)間為 19.8 min 的 GA21-20 和26.6 min的 GA21-26，離心濃縮除去甲醇和水。對(duì)樣品純度進(jìn)行高效液相色譜分析，分析條件如下：流動(dòng)相為51% 甲醇水溶液，流速為 1 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。GA21-20 保留時(shí)間 7.1 min 純度為 99%，GA21-26 保留時(shí)間為 10.4 min，純度為 99%。

2 結(jié)果

2.1 化合物 GA21-20 和GA21-26 的結(jié)構(gòu)鑒定

以甲醇為溶劑，化合物 GA21-20 和GA21-26紫外吸收光譜均在 248 nm 和312 nm 有最大紫外吸收，推測(cè)可能為 3, 4-二氫異香豆素類化合物[5]，GA21-20 的高分辨質(zhì)譜見圖 1。HR- ESIMS：[M+H]+實(shí)測(cè)值為 425.19292，理論值為 425.19184，分子式為 C20H28O8N2，不飽和度 ? = 8。由GA21-20 的13C-NMR 和DEPT 譜可知該化合物含 6 個(gè)季碳，9 個(gè)叔碳，3 個(gè)仲碳，2 個(gè)伯碳，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR 中的化學(xué)位移和1H-1H COSY、13C-1H COSY 可知 GA21-20 有 2 個(gè)甲基碳信號(hào)，3 個(gè)羰基碳信號(hào)，其中一個(gè)為酯羰基碳信號(hào)：1-C（δ = 169.0）、1 個(gè)酰胺羰基碳信號(hào) 7′-C（δ = 172.7）和1 個(gè)羧酸羰基碳信號(hào) 12′-C（δ =173.4）。由1H -1H COSY 觀察到 5-H（δ = 6.808，1H，d）與 6-H（δ = 7.472，1H，t）相關(guān)，7-H（δ = 6.839，1H，d）亦與 6-H 相關(guān)，再結(jié)合 HMBC譜，5-H 信號(hào)與 7-C（δ = 115.2）和8a-C（δ = 108.2）相關(guān)，6-H 信號(hào)與 4a-C（δ = 140.6）和8-C（δ =160.8）相關(guān)，從而可推斷出結(jié)構(gòu)式中含有的苯酚結(jié)構(gòu)；1H-1H COSY 譜表明 4′-H（δ = 2.120，1H，t 與δ = 1.326，1H，t）與 5′ -H（δ = 4.193，1H，t）、5′-H與 3-H（δ = 4.672，1H，dt），3-H 與 4-H（δ = 3.044，1H，t 和δ = 2.848，1H，d）相關(guān)；3′-H（δ = 1.650，1H，m）與 1′-H（δ = 0.831，3H，d）和2′-H（δ =0.906，3H，d）分別相關(guān)；結(jié)合 HMBC 可推出與苯環(huán)相連的部分結(jié)構(gòu)片段；此外，在1H-1H COSY譜中，出現(xiàn)了 8′-H（δ = 3.615，1H，d）和9′-H（δ = 3.908，1H，q），9′-H 和10′-H（δ = 3.125，1H，t），10′-H 和11′-H（δ = 2.299，1H，d 和δ =2.255，1H，d）相關(guān)，結(jié)合 HMBC，9′-H 與 7′-C（δ = 172.7），10′-H 與 8′-C（δ = 72.7）相關(guān)，從而推出了與 3, 4 -二氫異香豆素母核相連的側(cè)鏈基團(tuán)片段。綜合上述結(jié)構(gòu)特征以及 1D-NMR 和2D-NMR 的仔細(xì)解析，并與文獻(xiàn)[6]比較，確定了GA21-20 化學(xué)結(jié)構(gòu)與 Amicoumacin B 一致，結(jié)構(gòu)如圖 2 所示。GA21-20 的13C 和1H 信號(hào)歸屬如表 1。

圖1 GA21-20 高分辨質(zhì)譜圖Figure 1 HR-ESIMS of GA21-20

圖2 GA21-20 化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 2 Chemical structure of GA21-20

表1 GA21-20 的氫譜數(shù)據(jù)及其碳譜數(shù)據(jù)Table 1 1 H-NMR and 13C-NMR data of GA21-20

圖3 GA21-26 高分辨質(zhì)譜圖Figure 3 HR-ESIMS of GA21-26

表2 不同濃度 GA21-26 對(duì)白色念珠菌和稻瘟菌抑菌圈的直徑（mm）Table 2 Inhibitory zone diameter of compounds GA21-26 against Canidia albicans and Py ricularia oryzae (mm)

化合物 GA21-26 的紫外吸收峰與 GA21-20一致，高分辨質(zhì)譜見圖 3。HR-ESIMS：[M+H]+實(shí)測(cè)值為 436.20890；理論值為 436.20783，分子式為 C21H29O7N3，不飽和度 ? = 9，目前文獻(xiàn)報(bào)道的Amicoumacin 類似物中并沒有此分子量，因此其為一新的 Amicoumacin 族化合物，GA21-26 的核磁共振數(shù)據(jù)亦支持這一結(jié)論，新化合物 GA21-26 的化學(xué)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)解析、理化性質(zhì)將另文報(bào)道。

2.2 GA21 菌株發(fā)酵液粗品抗細(xì)菌及抗真菌活性

GA21 菌株發(fā)酵液粗品 50 ml，經(jīng) 4000 r/min離心 15 min，獲得發(fā)酵產(chǎn)物上清液，以等體積乙酸乙酯萃取上清液，減壓濃縮，獲得粗品。用 1 ml 甲醇溶解樣品，取 60 μl 溶解后的樣品分別加到直徑為 6 mm 的紙片上，待紙片揮干溶劑后貼于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、稻瘟菌、白色念珠菌測(cè)活平板上。觀察結(jié)果表明，發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對(duì)稻瘟菌、白色念珠菌具有抑制活性，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌無抑制活性。

2.3 化合物 GA21-20 和GA21-26 的抗真菌活性

采用倍半稀釋法使化合物 GA21-20 和GA21-26 在直徑為 6 mm 的紙片上濃度分別為80、40、20、10、5、2.5、1.25、0 μg。待紙片揮干溶劑后貼于白色念珠菌、稻瘟菌平板上，觀察抑菌圈直徑，結(jié)果如表 2 所示。GA21-26 在 2.5 μg/紙片對(duì)白色念珠菌即可顯示抑制活性，但在 80 μg/紙片才對(duì)水稻稻瘟菌顯示抑制活性，表明 GA21-26在拮抗醫(yī)學(xué)條件致病真菌方面有潛在用途。GA21-20對(duì)白色念珠菌和稻瘟菌均無抑制活性。

3 討論

枯草芽孢桿菌屬微生物可產(chǎn)生包括肽類、酯肽類、磷脂類、聚酮類、氨基糖類等[7]超過 20 種不同結(jié)構(gòu)類型的抗生素[8]，但大部分為肽類抗生素，其中包括核糖體途徑合成的肽類抗生素如枯草菌素（subtilin）、Ericin 和Mersacidin 等以及非核糖體途徑合成的酯肽類抗生素如表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）、豐原素（fengycin）等；同時(shí)，該屬微生物還能產(chǎn)生一些非肽類抗生素[9]，如聚酮類（polyketides）、萜類、異香豆素類抗生素等。異香豆素類具有廣泛的生物活性，如抗細(xì)菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、胃腸保護(hù)等，目前以微生物 Streptoverticillium eurocidicum 次生代謝產(chǎn)物 cytogenin 為模板，經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾的 NM-3 作為口服治療非小細(xì)胞肺癌藥物已進(jìn)入二期臨床試驗(yàn)，有望開發(fā)成新的抗腫瘤血管生成抑制劑類藥物[10-12]，可見異香豆素類化合物具有較好潛在的成藥性。本研究發(fā)現(xiàn)的 GA21-20 和GA21-26 屬于異香豆素類抗生素中具有 3, 4-二氫異香豆素母核的Amicoumacin，Amicoumacin 類抗生素 Amicoumacin A, B, C 最早由 Itoh 等[13]在 1981 年報(bào)道，其母核為 3, 4-二氫異香豆素，并在 3 位上固定連接甲基丁基氨基側(cè)鏈，隨氨基側(cè)鏈基團(tuán)變化，衍生出許多Amicoumacin 類似物。對(duì)已發(fā)現(xiàn) Amicoumacins 類化合物及結(jié)構(gòu)類似物的文獻(xiàn)調(diào)研表明，該類化合物主要來源于芽孢桿菌和真菌，少量來源于致病桿菌屬、放線菌屬等，目前文獻(xiàn)報(bào)道的微生物來源Amicoumacin 及其類似物有 16 種。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GA21 菌株除了能產(chǎn)生 GA21-20（Amicoumacin B）及 GA21-26 兩個(gè)化合物外，還能產(chǎn)生許多紫外吸收與之類似的小組分，如果通過 LC-MS 分析方法，在比對(duì)分子量的基礎(chǔ)上定向發(fā)現(xiàn)并進(jìn)一步純化該類新組分，開展生物活性研究，有望能進(jìn)一步從該菌株的次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的異香豆素類先導(dǎo)化合物。

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