紅色熒光蛋白在釀酒酵母中的表達(dá)特性研究

史彥薇，王志芳，王偉，安建梅，孔建強(qiáng)

紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)是從珊瑚綱生物中分離出來的一類與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）同源的熒光蛋白，其在紫外光的照射下可發(fā)射紅色熒光[1]。自 1999年首次被分離出來至今，紅色熒光蛋白以其激發(fā)和發(fā)射波長較長、細(xì)胞內(nèi)成像背景低、細(xì)胞毒性小而備受關(guān)注并廣泛應(yīng)用。迄今為止，紅色熒光蛋白已經(jīng)擁有多種突變體[2-10]，與最初的紅色熒光蛋白相比，突變體紅色熒光蛋白在成熟時(shí)間、熒光強(qiáng)度、發(fā)射波長以及聚集程度方面均有很大改觀，同時(shí)更多成熟時(shí)間短[2-4]、熒光強(qiáng)度強(qiáng)[5-7]、發(fā)射波長更長的單體紅色熒光蛋白[8-10]也得以成功開發(fā)應(yīng)用。不僅如此，紅色熒光蛋白性能的改善還使其更多地被用于分子標(biāo)簽[11-13]以及蛋白相互作用[14-16]的研究。為了更好地拓寬紅色熒光蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域，本實(shí)驗(yàn)嘗試將紅色熒光蛋白 Dsred 基因?qū)脶劸平湍妇瑢?shí)現(xiàn)紅色熒光蛋白在釀酒酵母菌體內(nèi)的異源表達(dá)；同時(shí)為縮短紅色熒光蛋白的成熟時(shí)間，對缺水環(huán)境中紅色熒光蛋白的表達(dá)特性進(jìn)行了分析，以期為紅色熒光蛋白更好地應(yīng)用于雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescent complementary，BiFC）[14-16]等蛋白互作技術(shù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 大腸桿菌菌株 E.coli TG1 和釀酒酵母菌株 W303-1B（MATa；ade2-1；his3-11,his3-15；leu2-3, leu2-112；ura3-1；trp1-1）均為本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T 載體購自寶生物工程（大連）有限公司；pYeDP60 釀酒酵母表達(dá)載體為法國Werck-Reichhart 教授饋贈(zèng)。

1.1.2 試劑與儀器 KOD Plus 高保真 DNA 聚合酶購自日本 Toyobo 公司；鮭魚精 DNA 購自日本 Wako 公司；聚乙二醇（PEG4000）購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；醋酸鋰和伴刀豆球蛋白購自美國 Sigma 公司；酵母質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；快速連接試劑盒 In-fusionTMAdvantage PCR Cloning Kit/Cloning Enhancer Kit 購自美國 Clontech 公司；蛋白Marker 購自立陶宛 Fermentas 公司；其他試劑均為分析純。

LB 大腸桿菌培養(yǎng)基（含 10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L NaCl；固體培養(yǎng)基添加1.5% 瓊脂粉）購自德國 Merck 公司；YPD 酵母培養(yǎng)基（含 10 g/L 酵母提取物、20 g/L 細(xì)菌蛋白胨、20 g/L 葡萄糖；固體培養(yǎng)基添加 2% 瓊脂粉）和 YPG 酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含 10 g/L 酵母提取物、20 g/L 細(xì)菌蛋白胨、20 g/L 半乳糖）購自英國Oxoid 公司；SCD 酵母脅迫培養(yǎng)基（含 7 g/L 無氨基酵母氮源、2 g/L drop-out 混合物、20 g/L 葡萄糖；固體培養(yǎng)基添加 2% 瓊脂粉）、SCG 酵母脅迫誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含 7 g/L 無氨基酵母氮源、2 g/L drop-out混合物、20 g/L 半乳糖）和 SC-Ade-Ura 培養(yǎng)基購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司。

Eclipse 80i 正置熒光顯微鏡為日本 Nikon 公司產(chǎn)品；Spectra Max190 酶標(biāo)儀為美國 MD 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Dsred 基因的克隆 采用連續(xù)重疊 PCR方法快速克隆 Dsred 基因[17]。根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的Dsred 基因的序列（GenBank：DQ005468）設(shè)計(jì) 8對引物（表 1）。在 8 對引物中，除 Fyedp60Red 和Ryedp60Red 之外，每條引物全長均為 59 nt（nucleotide，核苷酸），其中包括14 nt的重疊序列。所有引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

首先，以 Fred1 和 Rred1 互為模板，采用重疊 PCR 方法擴(kuò)增獲得 Dsred 基因初始序列，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為 50 μl，含 dNTP（2 mmol/L）5 μl、KOD Plus buffer 5 μl、KOD Plus 聚合酶 1 μl、Fred1 和 Rred1 各 1μl、MgSO4（25 mmol/L）2 μl、水 35 μl。然后，以該初始序列為模板，通過連續(xù)重疊 PCR 方法合成全長 Dsred 基因，擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：98 ℃ 10 s；98 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。反應(yīng)完畢，取 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物行 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

表 1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primers

將擴(kuò)增獲得的全長 Dsred 基因與 pMD-18T載體分別經(jīng) BamH I、EcoR I 雙酶切后，以 T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli TG1，篩選、挑取陽性克隆培養(yǎng)，進(jìn)行測序鑒定，序列鑒定正確的重組載體命名為 pMD-Dsred。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 以 Fyedp60Red/Ryedp60Red 為引物（表 1），采用連續(xù)重疊 PCR方法擴(kuò)增得到一條長約為 700 bp 的序列，將該序列通過In-fusion 方式連接到經(jīng) BamH I、EcoR I 雙酶切的載體pYeDP60 中，獲得含全長 Dsred 基因的 pYeDP60-Dsred 重組釀酒酵母表達(dá)載體，并進(jìn)行測序鑒定。載體構(gòu)建過程實(shí)驗(yàn)步驟參考快速連接試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)表達(dá) 采用LiAc 法[17]將測序鑒定正確的 pYeDP60-Dsred 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌 W303-1B，取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布在固體 SC-Ade-Ura 培養(yǎng)基上，28 ℃ 培養(yǎng) 3 ～ 4 d 后，挑取 3 個(gè)轉(zhuǎn)化子分別接種至 10 ml液體 SC-Ade-Ura 培養(yǎng)基，28 ℃ 培養(yǎng) 2 ～ 3 d。取3 ml 菌液，利用酵母質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，以提取質(zhì)粒為模板，F(xiàn)yedp60Red、Ryedp60Red 為上下游引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增篩選陽性克隆，獲得的陽性克隆命名為 W303B[pYeDP60-Dsred]。

挑取陽性克隆接種至 10 ml 液體 SC-Ade-Ura培養(yǎng)基，28 ℃ 培養(yǎng) 2 ～ 3 d 后，取 1 ml 菌液轉(zhuǎn)接至 50 ml 新鮮的液體YPG酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28 ℃ 誘導(dǎo) 24 h。取 1 ml 樣品，同時(shí)以轉(zhuǎn)化入pYeDP60 空載體的重組菌株 W303B[pYeDP60]作為空白對照，12 000 × g 離心 1 min，棄上清，取沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物鑒定 取誘導(dǎo)表達(dá) 24 h 的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌，12 000 × g 離心 1 min后收集菌體，去離子水洗滌 1 次后加入伴刀豆球蛋白（1 mg/ml）懸浮，涂于載玻片上，在 Eclipse 80i正置熒光顯微鏡下觀察綠光激發(fā)后的熒光成像。

1.2.5 重組蛋白對釀酒酵母生長的影響 將鑒定正確的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌分別接種至 YPD、YPG、SCG、SCD 培養(yǎng)基，培養(yǎng) 48、72、96、120、144 h 后分別取樣，利用酶標(biāo)儀測定波長600 nm 處酵母菌細(xì)胞的吸光度（A600）值，觀察重組 Dsred 蛋白對釀酒酵母菌生長的影響。

1.2.6 重組蛋白表達(dá)特性的分析 取誘導(dǎo)表達(dá)24 h 的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌液 15 ml，分裝入 15 管，每管 1 ml。實(shí)驗(yàn)分 3 組，每組5 管，分別進(jìn)行如下處理：第 1 組保持菌液狀態(tài)（菌液組）；第 2 組 12 000 × g 離心 1 min 后收集菌體，加入甘油后混懸（高滲組）；第 3 組12 000 × g 離心 1 min 后收集菌體（菌體組）。處理后將每組 5 管分別置于 –70、–20、4、28、37 ℃條件培養(yǎng)，每 24 h 取樣 1 次進(jìn)行熒光觀察。

2 結(jié)果

2.1 Dsred基因克隆

連續(xù)重疊 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果獲得長為 678 bp 的特異性條帶（圖 1）。將擴(kuò)增產(chǎn)物與 pMD-18T 連接，獲得的pMD-Dsred 重組載體測序結(jié)果表明，擴(kuò)增獲得的

圖 1 Dsred 基因連續(xù)重疊 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 The successive overlap PCR products of Dsred gene

圖 2 pYeDP60-Dsred 重組表達(dá)載體圖譜Figure 2 Map of recombinant expression vector pYeDP60-Dsred

圖 3 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌 PCR 擴(kuò)增篩選結(jié)果Figure 3 PCR amplification screening of the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred]

Dsred 基因與已經(jīng)發(fā)表的基因序列完全一致。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

采用 In-fusion 方法快速連接獲得的 pYeDP60-Dsred 重組表達(dá)載體經(jīng)測序鑒定顯示，克隆的Dsred 基因序列完全正確，表明目標(biāo)基因已成功插入重組表達(dá)載體，且 Dsred 基因表達(dá)受酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 GAL10-CYC1 調(diào)控，與理論設(shè)計(jì)完全相符（圖 2）。

2.3 工程菌的篩選與誘導(dǎo)表達(dá)

將 pYeDP60-Dsred 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母菌 W303-1B 后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，挑取 3 個(gè)克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示 3 個(gè)克隆均擴(kuò)增獲得了長為 700 bp 的特異性條帶，表明挑取的 3 個(gè)克隆均為陽性克隆，含有 Dsred 基因（圖 3）。

挑取陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，SDS-PAGE 分析顯示，誘導(dǎo)后工程菌的表達(dá)產(chǎn)物可見相對分子質(zhì)量為 28 kD 的特異性蛋白條帶，與預(yù)期蛋白相對分子質(zhì)量相符（圖 4）。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物鑒定

圖 4 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Figure 4 SDS-PAGE analysis of expression products of the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred]

W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h 后置于熒光顯微鏡下觀察，可見在綠光激發(fā)下，W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌被激發(fā)出紅色熒光，表明構(gòu)建的 pYeDP60-Dsred 重組表達(dá)載體可成功在釀酒酵母菌體內(nèi)正常表達(dá)（圖 5）。

2.5 重組蛋白對釀酒酵母菌的影響

將 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌分別接種至 SCG、SCD、YPG、YPD 培養(yǎng)基，培養(yǎng) 48 h 后連續(xù)測定 A600值，結(jié)果顯示抑制 pYeDP60-Dsred表達(dá)的 SCD、YPD 培養(yǎng)基與可誘導(dǎo) pYeDP60-Dsred 表達(dá)的 SCG、YPG 培養(yǎng)基內(nèi)釀酒酵母菌體生長無明顯差別（圖 6），表明重組 Dsred 紅色熒光蛋白表達(dá)對釀酒酵母菌體的生長影響很小，對釀酒酵母菌無毒性，不會(huì)抑制其生長。

2.6 高滲環(huán)境中重組蛋白的表達(dá)特性

W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌經(jīng)不同處理后，熒光顯微鏡下連續(xù)觀察各組紅色熒光蛋白的表達(dá)成熟時(shí)間，結(jié)果顯示在不同溫度條件下，高滲組紅色熒光蛋白的成熟時(shí)間均最短，菌液組時(shí)間最長，且持續(xù)時(shí)間較短。在 37 ℃ 條件下培養(yǎng)時(shí)紅色熒光蛋白成熟最早，然而也最不穩(wěn)定，熒光蛋白降解速度較快；在 4 ℃ 條件下培養(yǎng)時(shí)紅色熒光蛋白成熟時(shí)間雖然遲于 37 ℃，但最穩(wěn)定（表2）。

3 討論

紅色熒光蛋白是一種標(biāo)記分子，由于其激發(fā)和發(fā)射波長更長，細(xì)胞穿透力更強(qiáng)以及細(xì)胞毒性小而被廣泛應(yīng)用到基因表達(dá)與調(diào)控[18-19]、分子標(biāo)記[11-13]和蛋白相互作用[14-16]等領(lǐng)域。釀酒酵母菌是一種模式真核生物，以釀酒酵母菌為宿主的多種研究蛋白相互作用的技術(shù)，如酵母雙雜交[20-21]和酵母雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)[14-16]等也都已經(jīng)建立成熟。為了更好地將紅色熒光蛋白應(yīng)用至釀酒酵母菌為宿主的技術(shù)中，我們對紅色熒光蛋白在釀酒酵母菌內(nèi)的異源表達(dá)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，SDS-PAGE 和熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，pYeDP60-Dsred 重組表達(dá)載體已成功構(gòu)建和轉(zhuǎn)化，并可正常在釀酒酵母菌體內(nèi)表達(dá)，為紅色熒光蛋白的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

圖 5 W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌重組Dsred紅色熒光蛋白表達(dá)的熒光顯微鏡觀察（A：W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌相差結(jié)果；B：W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌綠色熒光激發(fā)結(jié)果；C：釀酒酵母菌W303B相差結(jié)果；D：釀酒酵母菌W303B綠色熒光激發(fā)結(jié)果）Figure 5 Fluorescent microscope images of recombinant Dsred red fluorescent protein expressed by the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred]. (A: Phase contrast image of the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred]; B: Image of the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred] excited by green fluorescence; C: Phase contrast image of Saccharomyces cerevisiae W303B; D:Image of Saccharomyces cerevisiae W303B excited by green fluorescence)

圖 6 重組Dsred紅色熒光蛋白對釀酒酵母菌生長的影響Figure 6 Effect of recombinant Dsred red fluorescent protein to Saccharomyces cerevisiae growth

表 2 不同條件下重組Dsred紅色熒光蛋白的成熟時(shí)間Table 2 The mature time of recombinant Dsred red fluorescent protein treated with different conditions

為了進(jìn)一步探究 pYeDP60-Dsred 重組表達(dá)載體對釀酒酵母菌生長的影響，我們將 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌分別接種至 SCG、SCD、YPG、YPD 培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)觀察。由于pYeDP60-Dsred 重組表達(dá)載體中 Dsred 基因受GAL10-CYC1 啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)，而 GAL10-CYC1啟動(dòng)子是一種半乳糖誘導(dǎo)、葡萄糖抑制型啟動(dòng)子，因此 SCG 和 YPG 培養(yǎng)基中 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌在半乳糖的誘導(dǎo)下，可產(chǎn)生重組Dsred 蛋白；但作為對照，SCD 和 YPD 培養(yǎng)基中W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌表達(dá)則受到抑制，無法產(chǎn)生重組 Dsred 蛋白。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌與抑制表達(dá)的工程菌生長情況基本一致，紅色熒光蛋白表達(dá)對釀酒酵母菌體生長無明顯影響。

高滲透壓環(huán)境是酵母細(xì)胞在生長繁殖過程中經(jīng)常遇到的脅迫現(xiàn)象之一，因此了解高滲透壓環(huán)境下紅色熒光蛋白在釀酒酵母菌內(nèi)的表達(dá)特性具有重要意義。在長期的生物進(jìn)化過程中，酵母逐步形成了抵抗外界脅迫環(huán)境的生理機(jī)制，即通過促進(jìn)一種或多種特殊溶質(zhì)（相容性溶質(zhì)）在細(xì)胞內(nèi)的累積從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透壓的平衡。這些相容性溶質(zhì)能在細(xì)胞內(nèi)以高濃度存在而不對細(xì)胞內(nèi)酶產(chǎn)生抑制或失活作用，甘油即為釀酒酵母菌和多種其他酵母菌細(xì)胞最主要的一種相容性溶質(zhì)。本研究通過對菌液進(jìn)行離心、加入甘油等處理，使釀酒酵母菌處于一種少水的高滲透環(huán)境中，結(jié)果表明高滲透壓環(huán)境能夠明顯縮短釀酒酵母菌內(nèi)紅色熒光蛋白的成熟時(shí)間，并使其長期保持穩(wěn)定。由此可得出結(jié)論，離心保留菌體和加入甘油等缺水處理都有利于紅色熒光蛋白的成熟。

自從紅色熒光蛋白被發(fā)現(xiàn)以后，各國科學(xué)家都通過對紅色熒光蛋白進(jìn)行體外分子進(jìn)化，獲得了多種成熟時(shí)間縮短的突變體，卻很少有實(shí)驗(yàn)涉及探討環(huán)境與成熟時(shí)間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過研究紅色熒光蛋白在高滲環(huán)境中的表達(dá)特性，證實(shí)除分子進(jìn)化之外，通過改變紅色熒光蛋白在宿主內(nèi)所處的環(huán)境，也能顯著地縮短其成熟時(shí)間，保持其穩(wěn)定性，進(jìn)一步拓寬了紅色熒光蛋白在釀酒酵母菌研究領(lǐng)域的應(yīng)用。

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