黏附因子在大腸埃希菌尿路感染中的作用

秦曉華, 王明貴

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，上海 200040

尿路感染(urinary tract infection, UTI)是最常見的感染性疾病之一，包括腎盂腎炎、膀胱炎和無癥狀性菌尿。由于泌尿道解剖結(jié)構(gòu)等方面的原因，女性尿路感染發(fā)病率顯著高于男性。臨床上，某些尿路感染不易治愈，即使泌尿道解剖和功能正常的患者尿路感染亦可反復(fù)發(fā)作。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，60%女性一生至少發(fā)生1次尿路感染，而25%患者急性膀胱炎可反復(fù)發(fā)作，年輕女性急性膀胱炎的發(fā)作頻率為平均每年0.5～0.7次/人。因尿路感染反復(fù)發(fā)作，患者反復(fù)就醫(yī)，長(zhǎng)期交替服用各類抗菌藥物，不但造成巨大身心和經(jīng)濟(jì)壓力，給社會(huì)帶來沉重醫(yī)療負(fù)擔(dān)，而且易導(dǎo)致二重感染，誘導(dǎo)臨床耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播。

大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)是尿路感染最常見的病原菌， 70%～95%社區(qū)獲得性尿路感染和50%醫(yī)院獲得性尿路感染由尿路致病性大腸埃希菌(uropathogenicE.coli, UPEC)引起[1]。黏附因子被認(rèn)為是UPEC的最重要毒力因子[2]。一方面，它可使UPEC黏附于宿主泌尿道上皮細(xì)胞，避免受尿液沖刷而被清除；另一方面，黏附因子可直接參與UPEC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的作用[2]；更重要的是，在黏附因子介導(dǎo)下，UPEC可入侵宿主細(xì)胞，并大量繁殖，形成細(xì)胞內(nèi)菌落群(intracellular bacterial community, IBC)，從而逃避宿主細(xì)胞釋放的炎癥因子及免疫效應(yīng)細(xì)胞的攻擊。UPEC成為胞內(nèi)寄生菌后，不僅對(duì)抗菌藥物敏感性下降，同時(shí)免疫原性也大大降低，成為尿路感染再燃或復(fù)發(fā)的潛在細(xì)菌貯存庫[3]。

黏附因子各亞基在細(xì)菌表面聚集并裝配成單體、寡聚體或超分子纖維結(jié)構(gòu)——菌毛，介導(dǎo)UPEC的黏附過程。UPEC主要黏附因子包括1型、P型、S型和F1C型菌毛及Afa/Dr黏附因子家族[2,4](表1)。本文綜述了上述黏附因子的表達(dá)及其在尿路感染中發(fā)揮的作用。

1 1型菌毛

1型菌毛由fim基因簇編碼。多個(gè)重復(fù)的FimA亞單位形成螺旋桿狀，構(gòu)成1型菌毛底部；頂部纖毛狀結(jié)構(gòu)則由黏附因子FimH與調(diào)配蛋白(adaptor protein)FimF和FimG形成。頂部蛋白FimH含一口袋狀結(jié)構(gòu)域，可識(shí)別宿主細(xì)胞表面含有甘露糖的糖蛋白受體，引起甘露糖敏感的紅細(xì)胞凝集反應(yīng)(mannose-sensitive hemagglutination, MSHA)。FimH直接介導(dǎo)UPEC與宿主細(xì)胞的黏附及入侵泌尿道上皮細(xì)胞的過程，同時(shí)參與胞內(nèi)生物膜樣菌落形成[5]。

敲除fimH基因的E.coli菌株感染人或小鼠后，細(xì)菌在人和小鼠泌尿道的定植力大幅下降[6,7]。不同表型的FimH均可識(shí)別宿主細(xì)胞膜含三甘露糖(trimannose)的糖蛋白受體，但與其他糖蛋白受體或非糖蛋白受體(如單甘露糖受體、Ⅰ或Ⅳ型膠原等)的結(jié)合力有較大差異[2]。80%從糞便中分離的共生E.coli所編碼的FimH只與三甘露糖蛋白受體結(jié)合，而70%的UPEC存在FimH表型突變，使其與三甘露糖蛋白受體的親和力下降，而與單甘露糖蛋白受體的親和力增加[8]。尿路上皮細(xì)胞表面以單甘露糖蛋白受體為主，因而存在FimH變異的UPEC更易在泌尿道定植。尿血小板溶素(uroplakin)廣泛分布于膀胱內(nèi)表面，具有加強(qiáng)和穩(wěn)定膀胱上皮細(xì)胞的作用，但尿血小板溶素1a (uroplakin 1a，UP1a)是FimH的主要受體，后兩者結(jié)合后啟動(dòng)UPEC入侵細(xì)胞的過程[9]。

1型菌毛不僅介導(dǎo)UPEC與宿主泌尿道上皮細(xì)胞的黏附與內(nèi)侵過程，更重要的是可直接參與IBC形成。細(xì)菌在侵入膀胱上皮細(xì)胞時(shí)，呈結(jié)構(gòu)松散的棒狀；而當(dāng)IBC形成后，則呈致密球狀[10]。IBC完全形成后不久，在某些信號(hào)誘導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)菌播散階段，UPEC變成細(xì)絲狀，從IBC中流出，并進(jìn)入鄰近上皮細(xì)胞，開始新一輪的胞內(nèi)繁殖和IBC形成過程，從而使UPEC在膀胱上皮細(xì)胞中播散，造成急性膀胱炎持續(xù)發(fā)作。周而復(fù)始的IBC形成過程會(huì)逐漸減慢并最終停止，形成細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌貯存庫，逃避宿主免疫系統(tǒng)和抗菌藥物的攻擊[11]。當(dāng)受侵襲的膀胱上皮細(xì)胞剝落時(shí)，細(xì)菌貯存庫被激活，侵入新的上皮細(xì)胞，再次開始IBC形成過程，造成宿主膀胱炎復(fù)發(fā)[11]。

Wright等[5]用菌株UT189-tetR/Ptet與對(duì)照菌株UT189-tetR經(jīng)尿道感染小鼠，并使其在四環(huán)素環(huán)境中生長(zhǎng)，可觀察到前期兩者在膀胱的定植水平和侵入膀胱上皮細(xì)胞的能力基本相同。但侵入上皮細(xì)胞后，在缺乏四環(huán)素環(huán)境中UT189-tetR/Ptet不能表達(dá)1型菌毛，膀胱內(nèi)總菌落數(shù)保持在0～102CFU/ml的低水平，且胞內(nèi)細(xì)菌松散分布，不能形成致密球狀的典型IBC；而對(duì)照株UT189-tetR表達(dá)1型菌毛，膀胱內(nèi)總菌落數(shù)保持在105CFU/ml左右，胞內(nèi)形成致密球狀的IBC，同時(shí)表達(dá)1型菌毛的區(qū)域與IBC區(qū)域完全一致，說明1型菌毛參與IBC形成，對(duì)維持宿主體內(nèi)細(xì)菌貯存庫起重要作用，并與尿路感染復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

有研究顯示，UPEC菌株fimH基因的陽性率很高，達(dá)91%(72/79)[12]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，健康人糞便標(biāo)本中分離的E.colifimH基因攜帶率也較高(81%，74/91)[13]。因此，fimH基因是UPEC菌株重要致病因子之一的觀點(diǎn)受到質(zhì)疑。

1型菌毛的FimH與膀胱上皮細(xì)胞結(jié)合可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程。小鼠泌尿道接種表達(dá)1型菌毛的UPEC，在接種后6 h內(nèi)觀察到大量膀胱上皮細(xì)胞脫落[7]。FimH可通過下調(diào)核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)表達(dá)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]，獨(dú)立介導(dǎo)UPEC與膀胱上皮細(xì)胞的相互作用。膀胱上皮大量脫落有助于清除大量病原菌，但使底層相對(duì)不成熟的細(xì)胞暴露于充滿UPEC的環(huán)境，更易受感染[2]。

2 P型菌毛

急性腎盂腎炎多為泌尿道定植菌逆行至腎臟引起的感染，其中80%病原菌為UPEC，而UPEC P型菌毛的表達(dá)與急性腎盂腎炎密切相關(guān)[15]。P型菌毛由腎盂腎炎相關(guān)菌毛(pyelonephritis-associated pili，pap)基因簇編碼，菌株536和UT189基因組中各有1套pap基因操縱子編碼P型菌毛，而菌株CFT073基因組中有2套編碼P型菌毛的pap基因操縱子，分別位于不同的致病島(pathogenicity island, PAI)[3]。P型菌毛結(jié)構(gòu)與1型菌毛相似，頂部蛋白PapG為主要黏附相關(guān)因子，可識(shí)別P血型紅細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞膜表面含α-Gal(1-4)- β-Gal組分的糖苷脂[15]，引導(dǎo)UPEC與上述細(xì)胞黏附。這種黏附不為外源性甘露糖阻斷，P型菌毛能介導(dǎo)甘露糖抵抗的紅細(xì)胞凝集(mannose-resistant hemagglutination, MRHA)。

PapG有3種類型：PapGⅠ、PapGⅡ和PapGⅢ，與不同的同功受體(isoreceptor)結(jié)合。宿主各組織細(xì)胞所分布的PapG同功受體類型不同，決定不同類型PapG的不同組織向性。PapGⅠ主要與含神經(jīng)酰胺己三糖的糖脂受體GbO3結(jié)合，該受體在人尿路上皮細(xì)胞中表達(dá)豐富；PapGⅡ主要與紅細(xì)胞糖苷脂GbO4結(jié)合，該受體在人尿路上皮中也表達(dá)豐富；PapGⅢ則與Fosrssman抗原(豚鼠組織抗原)GbO5結(jié)合，該受體在犬尿路上皮中表達(dá)豐富，而在人尿路上皮中表達(dá)不多。臨床上，PapGⅡ與人急性腎盂腎炎和菌血癥相關(guān)；PapGⅢ則與人膀胱炎和貓犬生殖泌尿道感染相關(guān)；PapGⅠ很少見，臨床特性不甚了解[16]。

基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，80%腎盂腎炎、60%膀胱炎和無癥狀菌尿及20%正常人糞便和尿液標(biāo)本中分離的E.coli攜帶pap基因[17]，而從25例腎盂腎炎合并敗血癥患者血培養(yǎng)標(biāo)本中分離的E.coli100%含pap基因[18]。55例反復(fù)尿路感染患兒糞便中分離的E.coli均攜帶pap基因，其中53例(96%)中段尿分離的E.coli含pap基因[17]。另一研究顯示，年齡為5個(gè)月以上的兒童中，急性腎盂腎炎UPEC菌株papGII基因檢出率(42/46，91%)高于非急性腎盂腎炎UPEC菌株papGII基因檢出率(5/11，45%)[19]。

對(duì)pap基因在尿路感染過程中所起的具體作用，至今頗有爭(zhēng)議。用基因重組技術(shù)構(gòu)造表達(dá)或不表達(dá)pap的E.coli感染小鼠模型后發(fā)現(xiàn)，表達(dá)pap的菌株在腎臟中停留時(shí)間更長(zhǎng)，說明P型菌毛可幫助UPEC更好地在泌尿道特別是腎臟中定植[20]。但另一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)，pap野生型和pap等位基因缺失突變型E.coli菌株分別感染小鼠后，小鼠尿液、膀胱及腎臟中2種菌的菌落計(jì)數(shù)無顯著差異[21]。

3 S型和F1C型菌毛

UPEC表達(dá)的S型和F1C型菌毛基因具有同源性。S型菌毛可引起MRHA，F(xiàn)1C型菌毛卻不能引起MRHA。S型菌毛結(jié)構(gòu)與1型及P型菌毛基本相似，頂端SfaS亞基是主要黏附因子。與SfaS結(jié)合的受體主要存在于腎臟上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞[22]。S型菌毛可介導(dǎo)細(xì)菌在組織間播散，并可透過正常血-腦屏障，與E.coli引起的敗血癥、腦膜炎有關(guān)[23]。另有研究發(fā)現(xiàn)，膀胱表面上皮細(xì)胞存在該菌毛受體，S型菌毛可能在膀胱炎發(fā)生中起一定作用。原位雜交技術(shù)也發(fā)現(xiàn)，S型菌毛可黏附于人膀胱和腎臟上皮[24]。F1C型菌毛(foc)與S型菌毛(sfa)基因同源，但識(shí)別受體不同，主要結(jié)合遠(yuǎn)端腎小管和集合管上皮細(xì)胞膜糖脂上的β-GalNAc-(1-4)-β-Gal殘基。

臨床上，25%～30%的UPEC分離株有sfa基因表達(dá)[25]。用PCR技術(shù)檢測(cè)急性膀胱炎、急性腎盂腎炎患者尿液中分離的UPEC及正常人糞便中分離的E.coli黏附因子基因，發(fā)現(xiàn)sfa與foc兩者只存其一，UPEC中含sfa或foc比例(35%)顯著高于正常糞便標(biāo)本中的E.coli(11%)，而急性膀胱炎(33%)與急性腎盂腎炎(42%)尿液標(biāo)本中UPEC含sfa或foc比例無顯著差異[26]。從54份尿路感染犬的尿液和糞便標(biāo)本中分離E.coli，發(fā)現(xiàn)僅從糞便分離的E.coli含sfa基因比例為6%，尿液或尿液、糞便同時(shí)培養(yǎng)的E.coli含sfa基因比例為54%[16]。也有研究發(fā)現(xiàn)，引起腎盂腎炎UPEC菌株的sfa基因陽性率(35%)高于引起膀胱炎的菌株(7%)[27]。雖然這些研究提示S型菌毛與尿路感染有一定聯(lián)系，但具體機(jī)制尚不清楚。

4 Afa/Dr黏附因子家族

引起人類腹瀉的E.coli中有一型因具有彌散黏附特性而被命名為彌散黏附型E.coli(diffusely adheringE.coli, DAEC)，表達(dá)Afa/Dr黏附因子的DAEC又常與尿路感染(包括腎盂腎炎、膀胱炎和無癥狀菌尿)相關(guān)[28,29]。Afa/Dr黏附因子家族成員按結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分3類：菌毛型(fimbrial)，包括Dr、F1845；無菌毛型(afimbrial)，有AfaE-Ⅰ、AfaE-Ⅱ、AfaE-Ⅲ、AfaE-Ⅴ、AfaE-Ⅶ和AfaE-Ⅷ；非菌毛型(nonfimbrial)，包括Dr-Ⅱ、Nfa-Ⅰ。編碼Afa/Dr黏附因子家族的基因在結(jié)構(gòu)和排列上均相似，A～D基因主要編碼輔助亞基，不同成員的該基因基本相同，而E基因編碼具有黏附特性的分子，因而存在一定差異[29]。其中C亞基對(duì)整個(gè)黏附結(jié)構(gòu)的組裝起重要作用[30]。Afa/Dr黏附因子有3種受體：Ⅳ型膠原、衰變加速因子(decay accelerating factor, DAF)及癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子家族(carcinoembryonic antigen-related cellular adhesion molecule, CEACAM)。不同黏附分子與3種受體的親和力各不相同。3種受體均在Afa/Dr DAEC致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[29]。

流行病學(xué)研究表明，表達(dá)Dr黏附因子的E.coli引起尿路感染再次發(fā)作的可能性要比無Dr黏附因子表達(dá)的E.coli高2倍，提示Dr黏附因子可能與尿路感染復(fù)發(fā)或慢性尿路感染相關(guān)[31]。draE等位基因突變后，Dr黏附因子不能完整表達(dá)，從而不能與Ⅳ型膠原結(jié)合。用上述draE突變型E.coli反復(fù)感染小鼠，建立慢性腎盂腎炎模型，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可被清除[32]，說明Dr黏附因子與Ⅳ型膠原結(jié)合幫助細(xì)菌在腎臟定植。同時(shí)，Dr黏附因子參與小鼠慢性腎盂腎炎時(shí)，不僅要與Ⅳ型膠原黏附，還需其他來源于宿主或細(xì)菌的因子參與對(duì)腎臟組織的破壞[33]。在相同小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，90%感染Dr黏附因子陽性E.coli的孕鼠早產(chǎn)，而感染Dr黏附因子陰性E.coli的孕鼠僅10%早產(chǎn)，原因可能與孕鼠DAF表達(dá)上升導(dǎo)致對(duì)Dr黏附因子陽性E.coli的敏感性提高有關(guān)[34]。但臨床UPEC菌株afa基因攜帶率并不很高(6%, 12/204)[35]。

DraE和AfaD黏附因子參與Afa/Dr DAEC侵入上皮細(xì)胞的過程。純化Dr菌毛并包被聚苯乙烯珠子，可觀察到肌動(dòng)蛋白在有Dr菌毛黏附處聚集，形成胞膜內(nèi)陷，最終將珠子吞入細(xì)胞[36]。draB、draC、draD和draE基因發(fā)生突變后，Dr黏附因子陽性E.coli不能進(jìn)入細(xì)胞，突變恢復(fù)后，可重獲內(nèi)侵能力[37]。Dr黏附因子陽性E.coli通過DAF引起α5β1整合素在細(xì)菌黏附處聚集，介導(dǎo)細(xì)菌入侵，該過程可被nocodazole阻斷，說明該過程有微管蛋白參與[38]。AfaEⅢ和AfaD也可介導(dǎo)細(xì)菌侵入細(xì)胞。

除上述主要黏附因子外，還有研究發(fā)現(xiàn)少數(shù)UPEC有其他黏附因子表達(dá)，但作用不甚清楚?？偟恼f來，UPEC黏附因子主要幫助細(xì)菌在泌尿道上皮定植，侵入細(xì)胞內(nèi)以逃避清除，形成尿路感染反復(fù)發(fā)作的細(xì)菌貯存庫；另外，介導(dǎo)宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)，參與炎癥過程。然而，除1型菌毛在尿路感染中的作用機(jī)制研究較清楚外，其他黏附因子的作用過程仍有很多不甚了解之處。對(duì)UPEC黏附因子作用的研究，有助于了解尿路感染反復(fù)發(fā)作的機(jī)制、研究清除病原菌的措施和開發(fā)尿路感染疫苗。

表1 UPEC 主要相關(guān)黏附因子Tab. 1 The major adhesins in uropathogenic Escherichia coli isolates

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